用于稳健质谱蛋白质组学的蛋白聚集捕获流程离心微流控自动化

用于液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）的蛋白质组学样品制备，正日益通过自动化方法加以实现。然而，在精准医学的临床场景中，往往需要以标准化和可重复的方式处理数量有限的样本，并尽可能减少用户干预，而完全自动化的工作流程仍较为少见。研究人员在此提出了AutoPAC-disk，这是一种蛋白聚集捕获（PAC）样品制备流程的离心微流控实现形式，面向自下而上蛋白质组学，能够自动完成珠上蛋白水解（on-bead proteolysis）所需的全部步骤，并实现缓冲液在芯片盘上的预存储（on-disk pre-storage）。以HEK293细胞裂解液对AutoPAC-disk进行比较评估，并与手工参考流程以及半自动机器人PAC实现进行对照，结果显示，在保持较高定量重复性的同时，肽段鉴定数分别增加50%和37%，蛋白组鉴定数分别增加23%和10%；蛋白组强度变异系数（CV）均低于10%。进一步分析表明，AutoPAC-disk主要提高了低丰度蛋白的鉴定数量，且未引入方法特异性的理化性质偏倚。随后，研究人员使用来源于患者的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）前列腺肿瘤组织对AutoPAC-disk进行评估。与手工流程相比，AutoPAC-disk获得了多8%的肽段鉴定数和多10%的蛋白组鉴定数，且两种方法的蛋白组强度CV均低于7%。综上，这些结果表明，结合芯片盘上缓冲液预存储的离心微流控自动化，能够显著简化蛋白质组学样品制备、减少用户交互，并降低缺乏蛋白质组学样品制备经验人员的操作门槛，从而为精准医学领域的临床与转化蛋白质组学提供一种有前景的策略。

该文发表于《Lab on a Chip》，聚焦于精准医学场景下质谱蛋白质组学样品制备自动化不足这一关键瓶颈。当前，基于质谱（MS）的蛋白质组学虽然已显示出在分子分型、诊断支持和治疗决策中的独特价值，但在临床常规流程中推广仍受限，核心障碍之一即为样品前处理流程复杂、人工依赖性强、标准化难度高。尤其在自下而上蛋白质组学中，液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析依赖高质量肽段生成，而蛋白聚集捕获（PAC）或单锅固相增强样品制备（SP3）虽然具有良好的去污染能力和重现性，却包含大量磁珠转移、洗涤和消化步骤，通常需要熟练人员操作。现有KingFisher或BRAVO等半自动平台虽可减少部分手工劳动，但仍依赖复杂设备、软件交互和有机溶剂处理，且更偏向高通量场景，不适合临床中每日个位数样本的应用需求。因此，研究人员开展本研究，旨在建立一种面向低样本量、低人工干预、低培训门槛且可标准化运行的全自动PAC样品制备系统。

研究人员据此开发了AutoPAC-disk，即一种基于离心微流控（centrifugal microfluidics）的PAC自动化平台。该系统通过离心力驱动液体输运，并结合热气动泵送（thermopneumatic pumping）和预装试剂条袋（stick pack）实现结合、洗涤、珠上消化和产物收集的全过程自动化。为适配微流控实现，研究人员首先对传统PAC流程进行重新设计，包括采用30 μm PureCube磁珠形成几何限域珠床、统一使用乙醇作为沉淀与洗涤相关溶剂，并验证有机溶剂预存储对流程性能的影响。随后以HEK293细胞裂解液将该平台与手工PAC流程及KingFisher半自动流程进行系统比较，并进一步在患者来源FFPE前列腺肿瘤组织中验证其临床相关性。研究表明，AutoPAC-disk不仅实现了流程自动化，而且在肽段和蛋白组鉴定深度上优于比较流程，同时保持良好的定量重现性。该工作的重要意义在于，研究人员首次实现了带有盘上缓冲液预存储的nLC-MS/MS蛋白质组学样品制备自动化，为临床和转化蛋白质组学的流程简化与可及性提升提供了技术基础。

研究所用关键技术方法可概括如下：首先，采用离心微流控芯片盘设计与热气动驱动策略，将PAC流程中的样品输入、乙醇结合、珠床洗涤、胰蛋白酶消化及洗脱整合于同一芯片中；其次，利用Orbitrap Exploris 480平台开展纳升液相色谱-串联质谱（nLC-MS/MS）检测，并结合数据非依赖采集（DIA）获得定量蛋白质组数据；再次，采用FragPipe、MSFragger与DIA-NN进行鉴定和定量分析，并在R中完成理化性质、变异系数和丰度分布分析；样本方面包括HEK293细胞裂解液以及经伦理批准获得的患者来源FFPE前列腺肿瘤组织。

在结果部分，论文首先以“Design concept and assay adaptations for microfluidic implementation”为题，说明为实现稳健微流控PAC，研究人员对实验体系进行了前置优化。研究显示，30 μm PureCube磁珠在合适蛋白:磁珠比例下，其肽段和蛋白组鉴定表现可与常规1 μm SpeedBeads相当，提示较大颗粒磁珠适于在无筛板附加结构的情况下构建稳定珠床。同时，研究比较了不同有机溶剂及浓度对蛋白结合效率的影响，结果表明最终乙醇浓度至少需达到70%（v/v）方可恢复与标准流程相当的蛋白质组覆盖度和重现性。进一步的条袋预存储实验则证明，预存储乙醇或乙腈并不会显著损害鉴定数量或流程稳健性，从而为盘上试剂集成提供依据。

在“Microfluidic AutoPAC-disk”部分，论文介绍了AutoPAC-disk的器件结构与自动化运行原理。该芯片盘每个盘面可并行处理2个样本，内部集成预装乙醇条袋、珠床反应腔、废液腔及产物收集腔。研究人员详细展示了样本、消化液和磁珠的上样方式，以及结合步骤中100%乙醇释放、样品向珠床转移、250 μL 80%乙醇洗涤、14 μL消化液导入和4小时37 °C珠上消化等关键环节。系统通过几何构型与热气动控制实现废液定向排出和消化液主动转移，支持长时间孵育并减少人为操作。

在“Comparative performance of the AutoPAC-disk, the manual, and KingFisher PAC workflows”部分，研究人员使用20 μg HEK293裂解液对三种流程进行比较。结果表明，AutoPAC-disk获得79 436条肽段和7643个蛋白组，显著高于KingFisher流程的57 832条肽段和6962个蛋白组，以及手工流程的53 088条肽段和6223个蛋白组。尽管AutoPAC-disk的蛋白组CV为7.5%，略高于KingFisher的3.2%和手工流程的4.1%，但均维持在10%以下，显示良好重现性。序列覆盖度分析进一步表明，AutoPAC-disk更高的肽段鉴定数转化为更高的蛋白序列覆盖。消化效率和肽长分析未发现其增加来源于非特异或半胰蛋白酶切割，因此其优势并非来自消化偏差。

随后，在针对丰度范围的深入分析中，研究人员通过蛋白组和肽段丰度排序、分位数热图及累积分布曲线揭示，AutoPAC-disk增加的鉴定主要集中于低丰度蛋白。蛋白组层面，在最低丰度分位区间内，AutoPAC-disk独有蛋白比例高于KingFisher和手工流程，说明其对低丰度蛋白的回收和检测更具优势。与此同时，方法特异性肽段和蛋白的疏水性、分子量和等电点（pI）分布总体相近，说明该平台未引入明显理化偏倚。研究人员据此认为，性能提升更可能源于珠处理方式差异：AutoPAC-disk中磁珠始终固定于几何限定珠床内，避免了KingFisher磁转移和手工反复重悬过程中潜在的珠损失及蛋白-珠聚集体扰动，从而改善总体回收率。

在“Application of the AutoPAC-disk to clinically relevant FFPE prostate tumor samples”部分，研究人员进一步将该平台应用于患者来源FFPE前列腺肿瘤样本。采用15 μg组织裂解物比较AutoPAC-disk与手工流程后发现，前者得到71 124条肽段和7336个蛋白组，较手工流程分别提高7.5%和9.9%。两种流程的CV分别为6.3%和5.9%，均表现出良好的定量稳定性。此外，AutoPAC-disk产生更多独有肽段和独有蛋白组，并在多数蛋白上实现更高的序列覆盖。HEK293中观察到的总体规律，包括无显著理化偏倚和对较低丰度分子的轻度偏向性增强，在FFPE样本中亦得到保持，证明该平台适用于临床相关复杂样本基质。

论文讨论部分的核心在于，研究人员通过多层次比较排除了若干可能解释。无论是磁珠化学性质、鉴定分子的理化特征，还是消化效率，都不足以解释AutoPAC-disk鉴定数增加的现象。相反，固定式珠床这一处理模式被认为是最关键的技术区别。该模式可能降低磁珠在转移步骤中的损失，减少反复重悬带来的变异，并维持蛋白聚集体在珠床中的稳定性，从而提高低丰度分析物回收。虽然AutoPAC-disk中完全切割肽比例略高，但研究人员指出，这一因素不太可能是主要驱动机制。因此，论文将性能提升归因于微流控固定珠床所带来的更稳健珠处理和更高整体回收，而非方法选择性改变。

研究结论部分可译为：本研究提出了AutoPAC-disk，这是一种带有盘上试剂预存储、可实现最小用户干预的PAC流程离心微流控实现形式，并展示了通过实验体系和流程优化，可建立一种精简的单一溶剂PAC方案，减少洗涤步骤并获得具有竞争力的蛋白质组学性能。研究人员以HEK293细胞裂解液将该系统与手工参考流程及KingFisher Apex平台上的PAC流程进行比较，验证了离心微流控用于全自动蛋白质组学样品制备的可行性和性能。尽管三种流程均具有良好的定量重现性，但该微流控方法与KingFisher流程和手工流程相比，分别实现了多37%和50%的肽段定量，以及多10%和23%的蛋白组定量。虽然鉴定率升高的精确机制尚未完全阐明，但新增鉴定体现为更高的序列覆盖，并且主要与低丰度蛋白相关。对流程特异性肽段的理化分析未见系统性方法偏倚，支持所观察性能差异的稳健性。AutoPAC-disk进一步应用于临床相关FFPE前列腺肿瘤组织时，延续了基准实验中的总体性能趋势，相较手工处理获得更多7.5%的肽段和9.9%的蛋白组。这些结果表明，该平台兼容复杂临床样本基质，并凸显其在未来转化蛋白质组学应用中的潜力。据研究人员所知，AutoPAC-disk代表了首个可利用预存储缓冲液实现nLC-MS/MS蛋白质组学样品制备的方案。通过减少磁珠操作和有机溶剂移液步骤，该系统降低了手工操作时间和运行复杂度。该精简流程有望通过降低技术门槛，促进基于MS的蛋白质组学在样品制备经验有限的实验室中获得更广泛应用。当前结果凸显了其在未来临床蛋白质组学流程中的应用前景，包括需要在一周内完成及时样本处理的分子肿瘤委员会（MTBs）。