背景(Background)：瓜氨酸(Citrulline, Cit)是精氨酸(Arginine, Arg)的有效前体，可逃逸肝脏首过代谢而被几乎完全吸收入体循环，并在肾脏被高效转化为Arg从而提高其系统生物利用率。本研究采用多组学分析探讨日粮Cit添加对泌乳母猪泌乳性能及所哺育哺乳仔猪肠道健康相关机制的影响。
结果(Results)：日粮添加Arg和Cit显著提高泌乳母猪平均日采食量(Average Daily Feed Intake, ADFI)；Arg组和40%Cit替代Arg组(40%Cit group)乳脂含量和血浆一氧化氮(Nitric Oxide, NO)浓度显著升高(P < 0.05)，乳苏氨酸(Threonine, Thr)含量呈升高趋势(P = 0.084)；21天哺乳期哺乳仔猪平均日增重(Average Daily Gain, ADG)亦显著改善。此外，母猪日粮40%Cit添加改善后代肠道健康——空肠形态学改善且紧密连接蛋白occludin表达上调(P < 0.05)，表明肠道屏障增强，该效应通过激活仔猪空肠mTOR(mammalian Target of Rapamycin)/S6通路实现。40%Cit添加上调线粒体融合与分裂相关蛋白(MFN2、MFF, P < 0.05)，OPA1(Optic Atrophy 1)蛋白表达呈升高趋势(P = 0.097)，提示线粒体结构与功能状态改善。40%Cit还调节仔猪肠道菌群，增加有益菌Lachnoclostridium丰度。母猪乳汁代谢组鉴定出58个差异代谢物(Differential Metabolites, DMs)，其中棕榈酸(Palmitic Acid)水平显著升高，且与肠道Lachnoclostridium丰度呈正相关(P < 0.05)。
结论(Conclusions)：日粮Cit添加通过激活仔猪空肠mTOR/S6通路、改善仔猪空肠线粒体结构与功能提升泌乳母猪泌乳性能并改善后代肠道屏障功能，上述获益进一步得到肠道菌群调节及乳脂与乳汁代谢组改变的支撑，最终促进仔猪生长。
研究背景与目的
精氨酸(Arginine, Arg)作为功能性氨基酸已被证实可改善母猪繁殖性能与泌乳性能，并促进哺乳仔猪小肠发育。然而口服Arg在肝脏发生广泛的首过代谢(first-pass metabolism)，限制其系统生物利用率。瓜氨酸(Citrulline, Cit)是Arg的内源性前体，可绕过肝脏首过分解代谢被几乎完全吸收入血，在肾脏经精氨琥珀酸合成酶(Argininosuccinate Synthase, ASS)和精氨琥珀酸裂解酶(Argininosuccinate Lyase, ASL)催化转化为Arg，从而更有效地提升循环Arg水平。虽有研究表明Cit可改善热应激下泌乳母猪的呼吸频率及仔猪断奶前死亡率，但正常生理条件下Cit对泌乳母猪生产性能及哺乳仔猪肠道健康的影响及其分子机制尚不清楚。因此，研究人员以经产大约克(Landrace)泌乳母猪及其哺乳仔猪为模型，通过等氮替代Arg不同比例(20%、30%、40%)的Cit日粮干预，结合母猪乳汁非靶向代谢组学、仔猪粪便16S rRNA测序及空肠组织Western blot蛋白检测，探究Cit改善泌乳性能及后代肠道健康的效应与机制，研究成果发表于Journal of Animal Science and Biotechnology 。
主要关键技术方法
将150头胎次、背膘、体重相近的经产大约克泌乳母猪随机分为5组(n=30/组)：对照组(基础日粮)、0.6% Arg组、20%Cit组、30%Cit组、40%Cit组(等氮替代Arg中Cit占比，以丙氨酸平衡氮)。记录母猪采食量与背膘，采集d 21泌乳母猪血浆、常乳及粪便，于d 21选取代表性仔猪屠宰取空肠组织。检测血浆激素与NO(一氧化氮, Nitric Oxide)、乳成分(乳脂、乳蛋白、乳糖及非脂固形物Solid Not Fat, SNF)与游离氨基酸、空肠形态学(Villus Height, VH；Crypt Depth, CD；VH/CD Ratio, VCR)与紧密连接蛋白(Occludin, ZO-1, Claudin-1)、消化酶活性；Western blot检测空肠p-mTOR、p-S6、p-4EBP1及线粒体动力学相关蛋白(MFN2, Mitofusin 2；MFF, Mitochondrial Fission Factor；OPA1, Optic Atrophy 1；PHB1, Prohibitin 1)；仔猪粪便16S rRNA V4–V5区扩增测序分析菌群α/β多样性及差异菌属；母猪乳汁非靶向液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)代谢组学鉴定差异代谢物(Differential Metabolites, DMs)并进行KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)富集；Spearman相关分析关联菌群-代谢物-肠道指标-ADG；统计学采用单因素方差分析与Duncan多重比较。
研究结果
Maternal Cit supplementation enhances lactation performance by modulating milk composition（母体Cit添加通过调节乳汁组成增强泌乳性能）
Arg组与各Cit组母猪平均日采食量(Average Daily Feed Intake, ADFI)均显著高于对照组(P < 0.01)，其中20%Cit组ADFI增幅最大(＋15.97%)。40%Cit组断奶时母猪体重高于Arg组，体重损失低于对照组(P < 0.05)。仔猪ADG呈改善趋势(P = 0.086)。40%Cit组与Arg组血浆NO显著升高(P < 0.05)，提示血管与代谢功能增强；40%Cit组血浆Cit浓度最高，30%Cit组血浆Arg浓度最高。Arg组与40%Cit组乳脂含量较对照组显著升高(P < 0.05)，乳Thr呈升高趋势(P = 0.084)。结论：泌乳期日粮Cit添加提高母猪采食量、降低体重损失、提升乳脂，并趋近改善仔猪ADG。
Maternal 40%Cit supplementation improves intestinal health in suckling piglets（40%Cit添加改善哺乳仔猪肠道健康）
40%Cit组仔猪空肠绒毛高度(Villus Height, VH)增加、隐窝深度(Crypt Depth, CD)降低、VH/CD比值(VCR)较对照组及30%Cit组显著升高(P < 0.05)；紧密连接蛋白occludin表达显著上调(P < 0.05)，ZO-1与claudin-1无变化；空肠胰蛋白酶(Trypsin)活性呈升高趋势(P = 0.087)。结论：40% Cit通过改善空肠形态、上调occludin及趋近提升消化酶活性增强仔猪肠道屏障功能。
Maternal 40%Cit supplementation improves the intestinal health of offspring via the mTOR/S6 pathway, as well as the structural and functional status of mitochondria（40%Cit通过mTOR/S6通路及线粒体结构功能状态改善后代肠道健康）
Arg及各Cit组仔猪空肠磷酸化mTOR(p-mTOR)与磷酸化S6(p-S6)蛋白水平均显著高于对照组(P < 0.05)，p-4EBP1无变化。40%Cit组MFN2与MFF表达显著上调(P < 0.05)，线粒体内膜融合蛋白OPA1表达呈升高趋势(P = 0.097)，线粒体代谢功能相关蛋白(COXIV等)无显著差异；空肠Cit转运载体SLC7A5(Solute Carrier Family 7 Member 5)表达趋近升高(P = 0.067)。结论：母体40%Cit激活仔猪空肠mTOR/S6信号并调节线粒体融合(MFN2, OPA1)与分裂(MFF)相关蛋白表达，改善线粒体动态平衡与结构完整性。
Maternal 40%Cit supplementation modulates gut microbiota in suckling piglets（40%Cit调节哺乳仔猪肠道菌群）
40%Cit组仔猪粪便菌群Chao1指数较Arg组升高(P < 0.05)，门水平Bacillota(旧称Firmicutes)相对丰度在Arg与40%Cit组均显著升高(P < 0.05)，属水平有益菌Lachnoclostridium丰度在40%Cit组较对照组显著增加(P < 0.05)。PICRUSt2功能预测显示碳水化合物与氨基酸代谢相关通路改变。母猪自身粪便α多样性在40%Cit组降低但优势菌群组成未变，乳汁微生物无显著变化，仔猪菌群改变不源于母源垂直传递。结论：40%Cit特异性重塑仔猪肠道有益菌丰度与功能谱。
Maternal 40%Cit supplementation alters the milk metabolome（40%Cit改变乳汁代谢组）
PLS-DA显示三组乳汁代谢谱分离明显(Q2 = −0.62提示无过拟合)。筛选出30个共有上调差异代谢物，其中棕榈酸(Palmitic Acid)在40%Cit组显著升高，亮氨酸(Leucine, Leu)与谷氨酰胺(Glutamine, Gln)降低。KEGG注释富集于脂肪酸生物合成与降解通路。结论：40%Cit使乳汁中促吸收供能的长链饱和脂肪酸——棕榈酸升高，可能通过乳汁组分间接影响仔猪。
Correlation analysis of intestinal differential microbiota of suckling piglets and ADG, milk metabolites and composition, intestinal barrier indicators, the mTOR signaling pathway and mitochondrial structural and functional protein（仔猪差异菌群与ADG、乳汁代谢物/成分、肠道屏障指标、mTOR通路及线粒体蛋白的相关性）
乳汁脂肪与Lachnoclostridium丰度呈正相关(P < 0.05)；空肠p-mTOR、p-S6及MFF与Bacillota丰度正相关(P < 0.05)；MFN2、OPA1与Lachnoclostridium丰度正相关(P < 0.05)；空肠VH与Bacillota正相关(P < 0.05)；乳汁棕榈酸与Lachnoclostridium正相关(P < 0.05)，Leu与Lachnoclostridium负相关，Gln与Bacillota负相关。结论：Cit介导的乳汁棕榈酸升高与Lachnoclostridium增殖相关联，菌群变化与激活的mTOR/S6及改善的线粒体/形态学指标正相关，提示"乳汁代谢物–菌群–肠道信号"级联参与Cit对仔猪肠道的调控。
讨论与结论总结
讨论指出Cit因避开肝脏首过代谢而比直接补Arg更有效提升循环Arg及NO，后者介导乳腺血流与乳脂合成；40%Cit提升乳脂及棕榈酸，棕榈酸促进Lachnoclostridium定植，该菌与空肠屏障指标及mTOR通路激活正相关；mTORC1激活可促进核编码线粒体mRNA翻译，本研究中MFN2与MFF上调提示线粒体融合/分裂动态平衡改善，MFN2亦被报道参与维持肠上皮屏障；乳汁游离氨基酸整体未变，提示mTOR激活非直接由乳氨基酸驱动，可能经由菌群或其代谢物介导。母猪自身菌群未同步改变，排除垂直传播，支持乳汁组分介导的间接调控假说。
结论(Conclusions)：日粮Cit添加是改善泌乳母猪泌乳性能的可行策略——表现为提高采食量、乳脂及有益乳汁代谢物(如棕榈酸)。这些母体改善通过上调仔猪空肠紧密连接蛋白occludin、激活mTOR/S6通路及改善线粒体结构与功能，促进哺乳仔猪ADG并增强其肠道健康；上述效应与Cit调节仔猪肠道有益菌(Lachnoclostridium)丰度及改变乳汁代谢组密切相关。本研究揭示了Cit通过母体–乳汁–后代轴调控仔猪肠道健康的潜在机制，为Cit作为泌乳母猪饲料添加剂的应用提供理论依据。
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