活体成像揭示神经胶质界膜屏障特性：健康与神经炎症中的中枢神经系统免疫特权新机制

本刊推荐：研究人员为探索中枢神经系统(CNS)免疫特权机制，开发了Aqp4-mRuby3基因敲入报告小鼠模型，首次实现活体条件下对血管周围和表层胶质界膜的可视化成像。研究发现胶质界膜对可溶性介质、微珠及免疫细胞具有屏障功能，并创建了可同步观测血管-软脑膜-胶质界膜三重屏障的CNS边界报告系统。该模型为研究多发性硬化(EAE)等神经炎症疾病中免疫细胞跨屏障迁移机制提供了关键工具，发表于Nature Communications。

在中枢神经系统的神秘疆域里，一场关乎生死存亡的防御战每天都在上演。神经元作为身体的指挥中心，需要绝对稳定的工作环境，而免疫细胞就像随时可能引发混乱的"不速之客"。为了平衡保护与防御的矛盾，中枢神经系统演化出了独特的"免疫特权"机制——就像中世纪的城堡那样，通过多重屏障结构将危险挡在门外。

这个精妙的防御系统包含两道关键防线：外层的血脑屏障(BBB)、血脑脊液屏障(BCSFB)和蛛网膜屏障(AB)构成了第一道城墙，而内层的胶质界膜(glia limitans)则形成了最后一道防线。虽然科学家早已了解外层屏障的重要性，但对胶质界膜这道最终防线的认识却始终模糊。它究竟如何阻止免疫细胞入侵？在神经炎症发生时又会发生什么变化？这些问题一直困扰着神经免疫学研究领域。

为了解决这些难题，来自瑞士伯尔尼大学的研究团队开发了一种革命性的研究工具——Aqp4-mRuby3基因敲入报告小鼠。这种小鼠能够通过红色荧光蛋白mRuby3标记水通道蛋白4(AQP4)，从而实现对胶质界膜的活体可视化观测。AQP4是星形胶质细胞上的一种水通道蛋白，在形成胶质界膜的星形胶质细胞脚板中高度极化表达。

研究人员通过将mRuby3序列插入Aqp4基因第二外显子，成功构建了表达AQP4-mRuby3融合蛋白的报告小鼠。实验证实，这种融合蛋白正确定位于血管周围星形胶质细胞脚板和表层胶质界膜星形胶质细胞，且杂合子小鼠的脑和脊髓水分平衡未受影响，实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)病程也未出现异常。通过双光子活体显微成像(2P-IVM)技术，研究团队首次在活体状态下清晰观测到大脑和脊髓的表层及血管周围胶质界膜。

为了更全面研究中枢神经系统的屏障系统，研究人员还将Aqp4-mRuby3小鼠与VE-cadherin-GFP小鼠杂交，创建了"CNS边界报告小鼠"。这种复合报告系统能够同步显示血管内皮和软脑膜纤维细胞的粘附连接(绿色荧光)以及胶质界膜(红色荧光)，为研究免疫细胞在不同中枢神经系统区室间的迁移提供了前所未有的可视化工具。

主要技术方法包括：基因编辑技术构建Aqp4-mRuby3报告小鼠模型；双光子活体显微成像(2P-IVM)技术进行大脑和脊髓的实时观测；免疫荧光染色进行组织学验证；透射电镜和连续块面扫描电镜(SBF-SEM)分析超微结构；实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)模型评估神经炎症反应；T细胞增殖实验分析免疫应答。

研究结果

Aqp4-mRuby3基因敲入小鼠实现胶质界膜离体可视化

通过将mRuby3荧光蛋白插入Aqp4基因第二外显子，研究人员成功构建了AQP4-mRuby3融合蛋白报告系统。免疫染色证实该融合蛋白正确定位于血管周围星形胶质细胞脚板和表层胶质界膜，与内源性AQP4蛋白分布一致。在视网膜内血-视网膜屏障处也检测到报告基因表达，证实了该模型的广泛适用性。

杂合子Aqp4-mRuby3报告小鼠脑脊髓水分平衡未受影响

对 homozygous 和 heterozygous Aqp4-mRuby3小鼠的脑脊髓水分含量测定显示，纯合子小鼠脑水分含量略有增加，但杂合子小鼠与野生型无显著差异。在EAE模型中，杂合子小鼠的疾病严重程度、脑脊髓水分含量以及脾细胞对MOG_35-55肽段的增殖反应均与野生型相当，证实报告基因表达不影响神经炎症进程。

杂合子Aqp4-mRuby3报告小鼠超微结构星形胶质细胞脚板形态完整

透射电镜分析显示，杂合子小鼠新皮层、小脑和脑干区域的血管周围星形胶质细胞脚板形态与野生型无显著差异。通过盲法分析将脚板形态分为正常、轻度肿胀和明显肿胀三类，发现两种基因型小鼠在各脑区的肿胀评分分布相似，表明AQP4-mRuby3融合蛋白表达不影响血脑屏障完整性。

杂合子Aqp4-mRuby3报告小鼠实现胶质界膜活体成像

通过颅窗、颅骨薄化和脊髓窗制备，研究人员成功实现了大脑和脊髓胶质界膜的活体成像。使用1045nm激发波长，在血管内注射FITC-葡聚糖标记血管腔的同时，清晰观察到血管周围胶质界膜的明亮AQP4-mRuby3信号和表层胶质界膜的弥散信号。SBF-SEM证实表层胶质界膜由星形胶质细胞体和突起而非脚板构成，与先前报道一致。

创建CNS边界报告小鼠

通过将Aqp4-mRuby3小鼠与VE-cadherin-GFP小鼠杂交，研究人员创建了能同步显示胶质界膜和血管-软脑膜边界的报告系统。这种复合模型允许在活体条件下同时观测血管内皮、软脑膜纤维细胞的粘附连接和胶质界膜，为研究中枢神经系统区室化提供了强大工具。

AQP4-mRuby3标记胶质界膜实现CNS驻留髓系细胞亚群分类

将Aqp4-mRuby3小鼠与CX3CR1-GFP髓系报告小鼠杂交后，研究人员成功区分了硬脑膜巨噬细胞、边界相关巨噬细胞(BAMs)和实质小胶质细胞。通过胶质界膜信号和硬脑膜胶原的二次谐波信号(SHG)，能够准确地将髓系细胞亚群定位到各自的中枢神经系统区室，解决了以往研究中仅依靠细胞形态或成像深度进行区分的局限性。

Aqp4-mRuby3报告小鼠实现胶质界膜屏障功能活体成像

通过小脑池注射FITC-葡聚糖和PEG化荧光微珠，研究人员发现这些示踪剂被限制在蛛网膜下腔(SAS)内，无法穿过胶质界膜进入脑实质。无论是在大脑还是脊髓中，10kDa的葡聚糖和1μm的微珠在注射后2小时内都未能跨越胶质界膜，证实了胶质界膜对可溶性介质和颗粒性物质的屏障功能。

CNS边界报告小鼠实现自身免疫神经炎症中CD4 T细胞与CNS边界相互作用的同步可视化

在EAE高峰期，通过2P-IVM观察发现，GFP+ 2D2 CD4 T细胞主要分布于蛛网膜下腔和实质内，硬脑膜中数量最少。追踪这些T细胞在不同CNS区室中的动态行为显示，位于胶质界膜下方的实质内CD4 T细胞具有更大的位移、更快的爬行速度和更高的方向性，表明CNS区室环境影响T细胞的迁移行为。

Aqp4-mRuby3报告小鼠实现CNS免疫监视和神经炎症中CD8 T细胞与胶质界膜相互作用的成像

在ODC-OVA小鼠模型中，OVA特异性CD8 T细胞在识别CNS中的抗原后，移动性降低，爬行速度减慢，方向性更随机。一些CD8 T细胞被观察到穿过胶质界膜进入CNS实质，并沿脊髓白质束纵向爬行。与CD4 T细胞相比，实质内CD8 T细胞表现出更高的方向性。

研究结论与意义

这项研究通过开发Aqp4-mRuby3报告小鼠模型，首次实现了胶质界膜在健康状态和神经炎症条件下的活体可视化，为理解中枢神经系统免疫特权机制提供了重要工具。研究表明胶质界膜对可溶性介质、颗粒物和免疫细胞具有屏障功能，并在神经炎症过程中发生显著变化。

研究人员创建的CNS边界报告系统能够同步显示血管、软脑膜和胶质界膜三重屏障，允许精确区分免疫细胞在中枢神经系统边界区室与实质内的定位，从而将它们在CNS免疫监视和神经病理学中的功能角色分开。这一技术突破为了解胶质界膜在中枢神经系统免疫特权中的主动作用提供了新的研究途径。

研究发现证实了胶质界膜作为进化上最古老的脑屏障，在哺乳动物中已转变为外脑屏障"后方"的第二道屏障。虽然它不完全禁止可溶性分子通过，但对免疫细胞具有屏障作用。在实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)中，临床疾病只有在免疫细胞穿过胶质界膜进入CNS实质后才开始发生，这赋予了胶质界膜在维持CNS免疫特权和组织稳态中的重要作用。

该研究还揭示了胶质界膜在中枢神经系统区室化中的关键角色，这些区室容纳了不同的CNS驻留髓系细胞亚群。通过区分边界相关巨噬细胞(BAMs)和实质小胶质细胞，研究人员能够更精确地研究这些细胞在神经免疫相互作用中的不同功能。

此外，研究结果对近年来提出的"类淋巴系统"假说提出了挑战。通过小脑池注射示踪剂，研究人员未观察到10kDa FITC-葡聚糖或1μm荧光微珠穿过胶质界膜或进入动脉周围间隙，这表明胶质界膜对可溶性介质和颗粒性物质具有屏障功能。

这项研究的发现不仅增进了我们对中枢神经系统屏障结构的理解，也为开发多发性硬化等神经炎症疾病的新治疗策略提供了潜在靶点。通过揭示胶质界膜在健康和解病状态下的动态变化，研究人员为未来针对这一特殊屏障的治疗干预奠定了坚实基础。

Aqp4-mRuby3报告小鼠的可用性将进一步推动我们对胶质界膜在中枢神经系统免疫特权中主动作用的理解，为神经免疫学研究开辟新的方向。这一模型将成为研究多发性硬化、脑水肿和其他神经系统疾病中胶质界膜功能的重要工具，有望在未来带来新的治疗突破。