H3.3染色质上PBAF/cBAF重塑复合物的重组在昼夜节律负反馈缺失条件下调控BMAL1活性

本研究揭示了组蛋白变体H3.3在肝脏昼夜节律调控中的核心作用。研究人员通过多组学技术发现H3.3标记的脆弱核小体为CLOCK-BMAL1转录因子异二聚体提供染色质平台，PBAF/cBAF复合物在此动态组装。在Per1/2双敲除模型中，ARID2缺失导致PBAF复合物解离并引发重塑复合物重组为BRM/cBAF主导状态，这解释了在昼夜节律负反馈缺失情况下BMAL1仍能保持活性的表观遗传机制。该研究为理解生物钟的表观调控提供了新范式。

生物体的昼夜节律调控是一个精密的内在计时系统，使生理活动与外界24小时环境周期同步。在分子层面，哺乳动物的昼夜节律核心机制依赖于转录-翻译反馈环（TTFL），其中激活因子CLOCK-BMAL1异二聚体被其转录输出产物PER和CRY蛋白周期性抑制。近年来研究发现，染色质环境的动态变化在节律性基因表达中起着关键作用，特别是组蛋白变体H2A.Z的节律性沉积已被证明参与调控BMAL1的结合活性。然而，其他组蛋白变体及其相关染色质重塑复合物如何协同CLOCK-BMAL1在变体染色质上工作的机制仍不清楚。

为了解答这一问题，Dominika Letkova等研究人员在《Nature Communications》上发表了他们的最新研究成果。他们发现组蛋白变体H3.3在肝脏染色质中的沉积在白天达到峰值，并且CLOCK-BMAL1特异性地被招募到H3.3核小体上。更重要的是，H3.3与CLOCK-BMAL1仅在昼夜节律周期的活跃阶段与PBAF和BRG1/cBAF复合物（SWI/SNF重塑家族成员）发生关联。在节律紊乱的Per1^-/-;Per2^-/-肝脏中，研究人员观察到PBAF复合物组装的核心组件ARID2显著减少，同时伴随着H3.3掺入的增加。令人惊讶的是，PBAF复合物的解体和BRG1的减少引发了重塑复合物的重组，使得BRM/cBAF复合物靶向BMAL1于更易接近的基因组位点。这种脆性的乙酰化H3.3核小体的富集和重塑复合物的重组，为PER介导的负反馈缺失情况下BMAL1仍能保持活性提供了机制解释。

研究人员运用了多种关键技术方法开展本研究：使用条件性基因敲入小鼠模型（FH-H3.3A^+/-）进行肝脏组织采样；通过原生免疫共沉淀（IP）结合质谱分析鉴定H3.3A相关蛋白复合物；采用原生染色质免疫沉淀测序（ChIP-Seq）分析H3.3A在全基因组范围的节律性沉积；通过实时生物发光记录技术监测小鼠胚胎成纤维细胞的昼夜节律周期；利用蛋白质免疫印迹和mRNA表达分析验证蛋白和转录水平的变化。

H3.3标记的核小体在CLOCK-BMAL1靶基因TSS处富集

研究发现H3.3A沉积在CLOCK-BMAL1靶基因和结合位点表现出节律性变化，从CT20开始稳步增加，在CT4达到峰值。在时钟输出基因上，在所有时间点都观察到转录起始位点（TSS）下游有定位良好的H3.3A核小体，延伸至近1kb处，而TSS上游的核小体主要在活跃阶段被检测到。昼夜节律E-box序列两侧都有循环的H3.3A核小体，但在短散在核元件（SINE）重复区域或基因间区域未检测到此类节律。

ARID2缺失导致PER缺失情况下PBAF复合物解组装

在PerKO肝脏中，H3.3A与特定PBAF组件和BRG1的相互作用显著减少，这种相互作用的丧失伴随着ARID2的近乎完全耗尽和核提取物中BRG1的大幅减少。尽管ARID2和BRG1减少，但PBRM1蛋白水平在PerKO组织中大多未受影响。内生PBRM1免疫沉淀实验证实，在野生型肝脏中，PBRM1相关的PBAF复合物在CT8时富含H3.3A，而在PerKO肝脏中，PBAF复合物缺失，BMAL1不再在PBRM1复合物中被检测到。

重塑复合物重组为cBAF/BRM复合物标记时钟紊乱状态

研究发现，在PerKO肝脏中，BRG1和ARID1B水平在输入组分中降低，导致cBAF/BRG1复合物组装减少。有趣的是，尽管ARID1B亚基总蛋白水平明显降低，但cBAF/BRM复合物组装在这些动物中未受影响。BMAL1与BRM在CT8和CT20共同免疫沉淀，令人惊讶的是，在PerKO染色质中也是如此。BRG1 ChIP-qPCR实验显示野生型和PerKO肝脏之间存在差异富集，而在时钟基因（如Per1、Per2、Cry2）以及直接靶基因（Dbp、Rev-erbα和Rorc）的E-box处，BRM ChIP-qPCR实验未见显著差异。

CLOCK-BMAL1被招募到脆弱核小体

同型H3.3核小体在活跃时钟阶段CT8时标有活跃的组蛋白修饰，包括H3K4me3和脆弱的H3K115ac/H3K122ac标记。12小时后，在抑制阶段CT20，这些标记几乎完全消失。PerKO肝脏的染色质富含H3K115ac，但H3K122ac相互作用减少，反映了持续的白天样"活跃"染色质状态。尽管有这种富集，CLOCK和BMAL1仅在野生型肝脏的活跃时钟阶段与脆弱的H3K115ac/H3K122ac标记的同型H3.3核小体共同免疫沉淀。

PerKO肝脏中脆弱的H3.3染色质增强E-box可及性

原生BMAL1 ChIP-seq分析显示，在PerKO染色质中，BMAL1在CLOCK-BMAL1位点处的富集显著增强。这些发现表明，PerKO肝脏中脆弱的H3.3染色质景观和改变的重塑动力学使得E-box基序更易接近。

研究结论表明，H3.3标记的脆弱核小体在建立促进CLOCK-BMAL1异二聚体结合和激活昼夜节律转录的染色质状态中起着关键作用。这些被PBAF/cBAF-BRG1复合物重塑的核小体有助于节律性染色质可及性。在PerKO肝组织中，PBAF-cBAF/BRG1复合物组装的丧失导致cBAF/BRM重塑复合物重组和BMAL1强烈靶向E-box。这些时钟结合位点可能通过增加脆弱H3.3核小体的掺入而在连接DNA中变得更容易接近。尽管同型H3.3核小体在PerKO染色质中未富集BMAL1，但CLOCK-BMAL1继续被招募到H3K115ac标记的H3核小体。BMAL1与cBAF/BRM重塑器的持续相互作用也可能是一种染色质机制，用于调节BMAL1活性，类似于在果蝇时钟中特定时钟基因所提出的机制。

该研究的重要意义在于揭示了组蛋白变体H3.3在昼夜节律调控中的核心作用，提供了在PER介导负反馈缺失情况下BMAL1仍能保持活性的机制解释。这不仅深化了对生物钟表观遗传调控机制的理解，也为节律紊乱相关疾病（如睡眠障碍、代谢性疾病甚至癌症）的治疗提供了新的潜在靶点。特别是研究发现Per1/2双敲除肝脏中出现的全局性H3.3沉积增加提示肝脏可能加速老化，这为理解昼夜节律紊乱与衰老过程的关联提供了新视角。此外，BAF/PBAF重塑器组件在癌症中的频繁突变与H3.3驱动突变在胶质母细胞瘤等恶性肿瘤中的作用，表明昼夜节律失调可能导致癌症表观基因组的重组，这为癌症预防和治疗提供了新的思路。