WEE1抑制剂通过激活GCN2激酶协同mRNA翻译缺陷诱导整合应激反应的机制研究

本研究揭示了WEE1小分子抑制剂（如AZD1775）通过脱靶激活GCN2激酶，诱导整合应激反应（ISR），与mRNA翻译缺陷（如GSPT1/ALKBH8缺失）产生协同毒性。研究发现PROTAC类WEE1降解剂可减少ISR激活，为优化癌症治疗策略提供了新方向。

癌症治疗领域近年来对WEE1抑制剂表现出浓厚兴趣，这类药物通过抑制细胞周期关键调控激酶WEE1，导致CDK1和CDK2过度活化，从而破坏细胞周期检查点并增强基因毒性。尽管多项临床试验正在评估AZD1775、Zn-c3和Debio0123等WEE1抑制剂的疗效，但其临床应用受到中性粒细胞减少症、血小板减少症等毒副作用的限制。这些毒性产生的机制尚未完全阐明，尤其令人困惑的是，某些遗传背景（如TP53缺失、KRAS突变等）的癌细胞对WEE1抑制剂特别敏感，但缺乏有效的预测生物标志物。

发表在《Nature Communications》的这项研究揭示了WEE1抑制剂的一个意想不到的作用机制：它们能够通过脱靶效应激活整合应激反应（integrated stress response, ISR），这是一种进化上保守的细胞信号通路，通过磷酸化翻译起始因子eIF2α（Ser⁵¹）来抑制全局蛋白合成并重编程基因表达。研究人员发现，这种激活是通过GCN2激酶实现的，与WEE1本身的抑制或细胞周期状态无关。

为了系统探索WEE1抑制剂的敏感性决定因素，研究团队在TP53缺失的RPE-1细胞中进行了 pooled CRISPR干扰（CRISPRi）筛选，靶向2000多个与DNA损伤反应（DDR）和细胞周期相关的基因。令人惊讶的是，筛选结果显示mRNA翻译相关基因GSPT1（翻译终止因子）和ALKBH8（tRNA修饰酶）的缺失使细胞对WEE1抑制剂AZD1775高度敏感。随后，研究人员使用分子胶化合物CC-90009（可降解GSPT1）进行验证，发现它与多种WEE1抑制剂（AZD1775、Zn-c3、Debio0123）均表现出强烈协同作用，而与PKMYT1、ATR或CHK1抑制剂的协同作用较弱。

机制研究表明，这种协同效应依赖于ISR通路的激活。Western blot分析显示，AZD1775处理可诱导GCN2（Thr⁸⁹⁹）和eIF2α（Ser⁵¹）的磷酸化，以及ATF4蛋白的积累。这种激活在多种癌细胞系和非癌细胞系中均被观察到，包括胰腺导管腺癌（PDAC）患者来源的类器官（PDOs）。重要的是，使用ISRIB（ISR抑制剂）或GCN2iB（GCN2激酶抑制剂）可以挽救由WEE1抑制剂和CC-90009联合处理引起的细胞死亡。

核糖体分析（Ribo-seq）数据进一步揭示，AZD1775处理重编程了mRNA翻译，增加了核糖体在ISR相关转录本（如ATF4、TRIB3）以及mTOR通路调控因子（如DDIT4、SLC7A5）上的占据率。通过L-AHA（一种可点击的蛋氨酸类似物）掺入实验，研究人员证实AZD1775和Debio0123降低了全局新生蛋白合成速率，而这种降低可被GCN2iB挽救。

为了区分WEE1抑制剂的on-target和off-target效应，研究团队使用了不依赖ATP竞争机制的WEE1分子胶降解剂（HRZ-1-057-1和HRZ-1-098-1）。这些化合物能有效降解WEE1蛋白，但本身不激活ISR。令人惊讶的是，在预处理的细胞中，AZD1775仍然能够强烈诱导ISR信号，表明这种激活是独立于WEE1 kinase的脱靶效应。

体外实验提供了直接证据：AZD1775能在体外直接结合并激活GCN2激酶。ADP-Glo实验显示AZD1775对GCN2的激活呈现特征性的"钟形"曲线，峰值在36 nM附近。热稳定性实验表明AZD1775与GCN2的结合改变了其热解折叠特性。这些发现与之前的激组谱分析结果一致，该分析显示AZD1775对GCN2激酶结构域具有高亲和力。

研究人员还发现WEE1抑制剂的毒性机制具有双重性：一方面是通过CDK过度活化引起的基因毒性（表现为γH2AX积累），另一方面是通过GCN2激活引起的ISR毒性。使用CRISPRi双色竞争生长实验，他们证明GSPT1和ALKBH8缺失与WEE1抑制剂的协同效应是ISR依赖的，而DUT、RRM2、PKMYT1和FZR1缺失的协同效应则是ISR非依赖的。

最有临床转化价值的是，研究团队发现PROTAC型WEE1降解剂（如ZNL-02-096，使用AZD1775作为warhead）比母化合物AZD1775诱导更弱的ISR激活，同时保持更强的基因毒性。另一种PROTAC降解剂ZNL-02-047也显示出类似的降低ISR激活的特性。这表明通过合理的药物设计，可以分离WEE1抑制剂的治疗效益和脱靶毒性。

主要技术方法包括：pooled CRISPRi筛选（使用DDR和细胞周期聚焦文库）；核糖体分析（Ribo-seq）检测翻译组变化；体外激酶实验（ADP-Glo和热稳定性分析）验证药物-激酶直接相互作用；患者来源类器官（PDAC PDOs）模型验证临床相关性；双色竞争生长实验定量遗传互作；AHA掺入结合流式细胞术检测蛋白合成速率。

CRISPR screen connects WEE1 inhibitors with mRNA translation defects

通过CRISPRi筛选，研究人员发现mRNA翻译相关基因（GSPT1和ALKBH8）的缺失使细胞对WEE1抑制剂敏感。使用GSPT1降解剂CC-90009验证了与WEE1抑制剂的强烈协同作用，这种协同依赖于ISR激活。

WEE1 small-molecule inhibitor treatment activates the ISR

实验证明AZD1775处理诱导了ISR标志物（p-GCN2、p-eIF2α和ATF4）的表达，这种激活可被GCN2抑制剂阻断。在多种细胞系和患者来源类器官中均观察到这一现象。

WEE1 inhibitors synergise via ISR-dependent and-independent mechanisms

CRISPRi竞争实验揭示WEE1抑制剂的协同机制具有双重性：与翻译缺陷的协同是ISR依赖的，而与核苷酸代谢和有丝分裂缺陷的协同是ISR非依赖的。

WEE1 inhibitors activate the ISR independent of WEE1

使用分子胶降解剂预先降解WEE1后，AZD1775仍能激活ISR，证明这种激活是WEE1非依赖的。体外实验证实AZD1775直接结合并激活GCN2激酶。

WEE1 PROTAC elicits less ISR toxicity compared to AZD1775

PROTAC型WEE1降解剂（ZNL-02-096和ZNL-02-047）比小分子抑制剂诱导更弱的ISR激活，同时保持基因毒性，提供了更精确的治疗策略。

研究结论强调，目前临床使用的WEE1小分子抑制剂缺乏对WEE1的特异性，其毒性部分来自脱靶激活GCN2介导的ISR通路。这种双重毒性机制既带来了挑战（剂量限制性毒性），也提供了机会（与翻译靶向药物的协同治疗）。通过使用PROTAC降解剂、分子胶或与ISRIB联合治疗，可以减轻脱靶毒性同时保持治疗效果。该研究建议将GCN2激活检测纳入激酶抑制剂特异性评估的标准流程，为优化癌症治疗策略提供了重要见解。