自热泳纳米马达通过放大铜离子干扰与免疫调控治疗耐药性植入物相关生物膜感染

针对骨科植入物相关生物膜感染（IABIs）因致密生物膜形成和局部免疫抑制微环境难以根除的问题，研究人员开发了基于铜过氧化物（CP）的Janus双球纳米马达（Motor@CP）。该马达在近红外（NIR）驱动下通过自热泳推进有效穿透生物膜，在酸性微环境中分解产生铜离子（Cu2+）、过氧化氢（H2O2）和羟基自由基（·OH），破坏生物膜完整性并诱导细菌类铜死亡（cuproptosis-like death），同时重编程巨噬细胞向促炎M1表型极化，增强抗菌免疫反应，为耐药性IABIs提供了无抗生素治疗新策略。

骨科植入物相关生物膜感染（Implant-Associated Biofilm Infections, IABIs）是骨科手术失败的主要原因，在临床实践中构成持续的重大挑战。由于植入物表面形成的致密微生物生物膜以及局部免疫抑制微环境，IABIs难以根除且复发率高。常见病原体如金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus, S. aureus）和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin-resistant S. aureus, MRSA）栖息于生物膜庇护所内，对传统抗生素和先天宿主免疫反应表现出强大抵抗力。此外，高度酸性、缺氧和营养耗竭的生物膜微环境（Biofilm Microenvironment, BME）有效削弱局部免疫能力，并促进促炎免疫细胞向抗炎表型极化，进一步复杂化了抗生物膜治疗策略。因此，开发能够有效破坏生物膜同时重编程免疫细胞的无抗生素治疗方法，对于以最小耐药风险改善IABIs治疗结果具有巨大潜力。

铜作为所有生物体必需的辅助因子，在众多生化过程中起关键作用。然而，当其浓度超过进化保守的稳态机制调节的阈值时，铜变得有毒并破坏细菌代谢。具体而言，铜在细胞结构内的积累与三羧酸循环（Tricarboxylic Acid Cycle, TCA）的脂酰化组分相互作用，引发细胞铜死亡和细菌类铜死亡，为基于铜的治疗纳米材料提供了见解。此外，铜离子在暴露于BME时可通过类芬顿反应产生活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS），增强巨噬细胞免疫功能，促进对从解体生物膜逃逸的浮游细菌的趋化、吞噬和促炎细胞因子释放。因此，由于其直接的抗菌能力 coupled with 优异的免疫细胞重编程效果，基于铜离子的治疗被认为是后抗生素时代无抗生素治疗的有希望的候选者。

铜过氧化物（Copper Peroxide, CP）纳米点作为新兴的铜离子供体，在酸性条件下分解为铜（II）和过氧化氢（H₂O₂），随后生成羟基自由基（·OH），有助于破坏细菌膜完整性，从而增强铜摄取并促进铜死亡。然而，铜离子的功效显著受细菌细胞内铜积累的影响，主要由于两个关键因素：致密生物膜限制铜离子渗透效率；细菌发展出多种防御机制，包括增强外排系统以排出过量铜和产生结合游离铜的物质，减少能够诱导类铜死亡的内部浓度。因此，确保促进铜离子在现有成熟生物膜内广泛分布的有效递送方法是IABIs管理的关键挑战。

近年来，具有自主运动能力的纳米马达因其穿透屏障和有效递送药物的卓越能力而受到越来越多的关注。近红外（Near-Infrared, NIR）激光推进的纳米马达显示出克服复杂生理屏障的巨大潜力，因其无燃料性质和稳定运动特性，具有广泛的应用前景。本研究引入了一种BME响应性自热泳Janus双球纳米马达（Motor@CP）来增强骨科IABIs的根除。

研究人员首先使用介孔硅纳米颗粒（Mesoporous Silicon Nanoparticle, MSN）作为基底，金纳米颗粒（Gold Nanoparticle, AuNP）作为光热结构构建Janus双球纳米结构（Motor），随后将CP纳米点封装在MSN内形成Motor@CP。该马达在NIR驱动下通过自热泳推进表现出显著的自主运动，有效穿透不同细菌物种的致密生物膜并广泛递送CP。酸性BME（pH~5.5）促进CP爆炸性分解为铜（II）和H₂O₂，随后通过类芬顿反应生成·OH。由于其自主运动和自我供应H₂O₂生成，Motor@CP+NIR substantially 破坏生物膜内的细胞外DNA（extracellular DNA, eDNA）组分，显著改变其完整性和渗透性，促进Motor@CP的增强渗透。体外实验表明，Motor@CP+NIR将S. aureus和大肠杆菌（Escherichia coli, E. coli）的细胞内铜离子摄取分别提高3.4和4.1倍，破坏TCA循环并诱导广泛的类铜死亡细菌死亡。此外，Motor@CP显著重编程浸润巨噬细胞向促炎表型，促进抗菌免疫反应。

为开展本研究，研究人员采用了几个关键技术方法：通过Pickering乳液法构建Janus双球纳米结构；利用透射电子显微镜（Transmission Electron Microscopy, TEM）和高分辨率TEM（HRTEM）表征纳米材料形貌；使用X射线光电子能谱（X-ray Photoelectron Spectroscopy, XPS）分析元素价态；通过电感耦合等离子体光学发射光谱（Inductively Coupled Plasma Optical Emission Spectrometry, ICP-OES）定量铜离子释放和摄取；采用流式细胞术评估活性氧水平和巨噬细胞表型；通过RNA测序（RNA-seq）分析差异表达基因；使用共聚焦激光扫描显微镜（Confocal Laser Scanning Microscopy, CLSM）观察生物膜穿透和细菌存活状态；并建立小鼠IABIs模型进行体内治疗效果评估。所有动物实验均经郑州大学机构动物实验伦理委员会批准（批准号2023-KY-0433-001），使用Balb/C小鼠建立植入物感染模型。

体外抗生物膜功效和CP与Motor@CP的表征

研究发现常规铜离子供体二水合氯化铜（CuCl₂·2H₂O）在安全浓度范围内对浮游细菌表现出有效的剂量依赖性抗菌活性，但对生物膜效果有限， likely due to 生物膜的致密细胞外聚合物物质（Extracellular Polymeric Substance, EPS）。CP纳米点作为新兴的金属过氧化物，在酸性条件下独特地提供H₂O₂和芬顿型铜（II）， enabling 自我供应的化学动力学治疗。TEM图像和尺寸分布分析确认了CP纳米点的成功合成，其均匀尺寸约为5 nm。比色 assay 证明CP释放的H₂O₂通过氧化还原反应导致KMnO₄褪色（从紫色到无色）。同样，CP生成·OH自由基的能力通过TMB氧化和颜色变化在650 nm处的吸收峰证明。XPS分析显示CP和CP+NIR中铜离子价态保持+2价，表明NIR照射不改变CP中铜离子的价态。CP在不同pH水平（7.4、6.5和5.5）的磷酸盐缓冲盐水（Phosphate-Buffered Saline, PBS）中持续铜离子释放监测 clearly demonstrated 其酸响应性质。CP能够在12小时内实现69.9±4.3%的H₂O₂生产，为增强类芬顿反应创造有利条件。S. aureus和MRSA培养物中的生物膜 pellets exhibited 低pH，创造有利于CP纳米点生成H₂O₂、铜（II）和有毒·OH的酸性环境。

随后在S. aureus和MRSA生物膜中进行的常规抗生物膜实验证明CP在生物膜根除方面优于CuCl₂·2H₂O。ICP-OES分析进一步证实CP处理导致S. aureus和MRSA生物膜内铜含量增加， attributed to CP的自我供应H₂O₂能力，增强ROS生产并干扰铜离子摄取和外排通道。与传统铜离子供体相比，这些发现突出CP在促进生物膜感染中细胞内铜积累的潜力。L929细胞、RAW 264.7细胞和HUVEC细胞上各种浓度CP纳米点的体外细胞毒性评估使用CCK-8 assay 确定4 μg ml^-1 represents 最佳抗生物膜浓度同时 exhibit 对正常细胞 negligible 细胞毒性效应。

Motor@CP的运动性能和生物膜穿透行为

利用NIR光的不对称吸收，Janus双球纳米马达Motor@CP能够产生自热泳推进。最初，研究人员监测了含有Motor@CP的水溶液在不同NIR激光照射强度下的温度变化。结果表明，溶液温度随NIR激光强度比例增加，实现~30.6%的光热转换效率。在PBS溶液（pH 7.4）中，Motor@CP在不同NIR激光功率强度下的代表性跟踪轨迹被观察。值得注意的是，Motor@CP的运动距离随NIR激光功率提升逐渐增加。具体而言，在无NIR激光照射（0 W cm^-2）下，运动不规则；在低强度照射（0.5 W cm^-2）下，运动相对随机；相比之下，具有Janus双球结构的Motor@CP在较高NIR激光功率（1.0和1.5 W cm^-2）下表现出更多定向运动。在不同NIR激光照射（0.5、1.0和1.5 W cm^-2）下，Motor@CP的速度分别为4.2±0.9 μm s^-1、8.3±0.7 μm s^-1和11.2±0.8 μm s^-1。均方位移（Mean Square Displacement, MSD）和相应有效扩散系数（D_eff）显示显著增加。

为模拟皮下酸性生物膜微环境，研究人员进一步评估了马达在酸性PBS（pH 5.5）中的性能，覆盖2.0 mm厚猪肉火腿片。Motor@CP的温度增加与NIR激光功率增加成比例。在酸性溶液中随着NIR激光功率增加（0.5、1.0和1.5 W cm^-2），Motor@CP的速度计算为4.8±0.4 μm s^-1、8.7±0.6 μm s^-1和11.6±0.8 μm s^-1，相应的MSD和D_eff也 exhibit 显著增加。这种优越的自热泳能力可能促进更有效地渗透生物膜以递送铜离子。

CP加载后的铜离子释放行为使用ICP-OES评估。在PBS（pH 5.5）中24小时内，CP、Motor@CP和Motor@CP+NIR（4 μg ml^-1，以CP表示）的铜离子释放比率分别为70.1±2.2%、66.3±3.4%和72.6±3.0%，实际铜离子浓度分别为1.362±0.043、1.287±0.067和1.412±0.052 μg ml^-1。这意味着Motor@CP+NIR通过自主纳米马达运动和ROS生成在较低铜离子浓度下实现更高效的抗生物膜效果。

高效纳米颗粒穿透致密生物膜保护层对于破坏生物膜完整性和通过铜离子释放有效消除细菌至关重要。因此，本研究通过将不同纳米颗粒与生物膜共孵育评估了它们的渗透特性。在此之前，通过体外溶血和细胞毒性 assay 评估样品的生物相容性。所有样品的溶血比率低于5%，与阴性对照（PBS溶液）相当，表明优异的血液相容性。此外，使用CCK-8 assay 评估了在不同浓度和NIR激光功率强度下的体外生物相容性。与L929细胞、RAW 264.7细胞和HUVEC细胞共培养24小时后，Motor@CP+NIR在浓度（4 μg ml^-1，以CP表示）下表现出优异的生物相容性。在后续实验中，采用1.0 W cm^-2的NIR激光功率，因此功率水平使Motor@CP表现出优越的运动性能同时施加 negligible 细胞毒性效应。

随后，为模拟皮下生物膜感染的真实条件，使用transwell系统量化穿透能力。S. aureus生物膜建立在顶室中，罗丹明B标记的荧光纳米颗粒引入该室，表面覆盖2.0 mm厚猪肉火腿片。评估了Motor@CP通过生物膜的穿透效率 under 不同持续时间NIR激光照射。延长激光暴露显著增强Motor@CP的穿透功效，在5分钟照射后实现 near-optimal 效率（>90%）。此外，照射10分钟 demonstrate 穿透效率无显著增加，而 prolonged 照射可能导致不期望的组织热损伤。因此，在整个实验中选择5分钟激光照射时间。此外，通过测量5分钟激光照射后基底室中的荧光强度比较了不同纳米颗粒的生物膜穿透效率。结果表明，Motor@CP+NIR的生物膜穿透比率比CP组高14.2倍，突出具有自主运动的Motor@CP+NIR在穿透生物膜方面的 exceptional 潜力。进一步进行3D CLSM following 罗丹明B标记纳米颗粒与S. aureus和E.coli生物膜的孵育。结果表明，Motor@CP+NIR表现出强大的穿透到S. aureus和E.coli生物膜中。相比之下，单独CP组观察到 negligible 穿透。这些发现表明Motor@CP+NIR的自热泳推进显著增强生物膜穿透并 exhibit 对不同生物膜的广谱适用性。

Motor@CP的体外抗生物膜活性

选择革兰氏阳性（S. aureus和MRSA）和革兰氏阴性（E. coli）细菌的代表作为模型生物膜形成生物，以研究Motor@CP的体外抗生物膜活性。这些细菌培养3天以建立稳定生物膜，随后进行不同处理，包括对照（未处理）、CP、Motor、Motor@CP和Motor@CP+NIR，以验证其对生物膜根除的治疗效果。与 established 生物膜共孵育12小时后，Motor@CP+NIR组 exhibit S. aureus、MRSA和E. coli生物膜的OD₆₀₀值显著减少。结晶紫染色显示，虽然对照和Motor组保持完整生物膜结构，但CP和Motor@CP处理组显示具有部分结构损伤但 largely preserved 存活力的生物膜。涂布平板法（Spread Plate Method, SPM）分析进一步证实Motor@CP+NIR处理组中生物膜内细菌存在显著减少，菌落形成单位（Colony-Forming Unit, CFU）分析证明Motor@CP+NIR处理实现99.9%细菌清除率，表明对细菌生长和生物膜形成的 superior 抑制。该清除率显著高于任何其他处理组，确认Motor@CP+NIR提供最有效的生物膜破坏。

S. aureus和MRSA生物膜的3D CLSM图像用于评估生物膜破坏程度。在Motor@CP+NIR组中，观察到生物膜结构的显著破坏， characterized by 强烈红色荧光，强烈指示高度细菌细胞死亡。该发现强调治疗在根除生物膜方面的有效性。此外，SEM图像显示对照、CP、Motor和Motor@CP组中具有完整形态的致密细菌菌落。相反，用Motor@CP+NIR处理的生物膜内的细菌 exhibit predominantly 皱缩、扭曲或完全裂解的细胞， thereby 确认治疗在根除生物膜方面的有效性。单独研究AuNPs的光热效应，结果表明在1.0 W cm^-2功率下，AuNPs alone 对生物膜的光热效应 negligible。 collectively，这些结果表明单离子治疗（CP或Motor@CP组）表现出中等抗生物膜活性，而Motor@CP+NIR组通过利用自热泳纳米马达 demonstrate 在体外消除生物膜的 superior 功效。

Motor@CP的抗菌机制

使用Bio-TEM研究不同处理后S. aureus和E. coli的超微结构和细胞内铜离子摄取。暴露于Motor@CP+NIR的S. aureus和E. coli exhibit 更显著的结构破坏。进一步元素映射分析显示，与CP组相比，Motor@CP+NIR组细胞内铜浓度显著更高，表明增强铜离子内化。为量化该观察，进行ICP-OES分析。结果表明，用Motor@CP+NIR处理的S. aureus和E. coli的细胞内铜水平分别显著增加3.4和4.1倍，确认大量铜离子流入。该增强铜摄取可归因于自主运动和ROS生成的协同效应，导致增加膜渗透性。

细胞外DNA（eDNA）在生物膜的形成、成熟和结构稳定性中起关键作用。通过SYTOX green nucleic acid staining of S. aureus和E. coli生物膜中的eDNA，结果表明Motor@CP+NIR组 exhibit 生物膜内 superior eDNA降解。这是由于自主运动 enable 穿透生物膜结构并同时递送CP以破坏eDNA组分。此外，进行蛋白质泄漏 assay 和O-硝基苯基-β-D-半乳吡喃糖苷（ONPG）水解 assay 以评估细菌内容物泄漏，为受损膜完整性提供进一步证据。这些发现强烈支持Motor@CP+NIR处理显著损害S. aureus和E. coli生物膜和细菌膜的完整性并改变其渗透性，导致明显细胞质泄漏的结论。

受上述发现鼓舞，研究人员使用S. aureus的RNA-seq分析进行深入调查以比较CP和Motor@CP+NIR组之间的差异表达基因（Differentially Expressed Genes, DEGs）。主成分分析和热图相关性分析显示显著表达差异同时证明每组内最小变异性， thereby 验证RNA-seq数据的可靠性。共识别3,043个变量，与CP组相比，Motor@CP+NIR组中703个基因显著上调，665个基因下调。基因本体论（Gene Ontology, GO）富集分析表明破坏 primarily 影响细菌细胞代谢和催化活性， specifically 影响肽、蛋白质、酰胺和大分子的代谢。这表明细菌代谢途径和酶功能的 substantial 改变，对维持细胞稳态和大分子合成至关重要。

京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）对DEGs的富集分析显示，Motor@CP+NIR处理显著抑制S. aureus在关键途径如柠檬酸循环（TCA）、核糖体、嘧啶代谢、核黄素代谢和 several 氨基酸代谢途径，如 top 20 富集代谢途径所示。值得注意的是，TCA循环特别受影响，具有高富集指数和低p值，为类铜死亡机制提供 compelling 证据。铜死亡，一种最近识别的由铜离子诱导的细胞死亡形式，导致TCA循环中四种与硫辛酸相关的酶积累， thereby 破坏铁硫（Fe-S）簇蛋白的活性。有趣的是，我们的分析证明Motor@CP+NIR处理导致与细菌类铜死亡现象相关的基因上调或下调。这表明铜依赖性形式的细菌死亡，类似于真核细胞中观察到的过程。

为更清晰阐明机制，研究人员进行qPCR assay 以验证TCA循环中相关基因和代谢物的水平。定量结果表明，与对照和CP组相比，Motor@CP+NIR组 exhibit 相关基因的最高水平和代谢物的最低水平。差异代谢物和差异表达基因之间的机制分析示意图生动说明TCA循环中的变化。 collectively，在ROS影响下，用Motor@CP+NIR处理的细菌显示增加细胞内铜，其与脂肪酰基转移酶（DLAT、DBT和DLST）结合，导致其失活和随后整个途径代谢物减少。此外，由于形成更多脂酰化蛋白质，硫辛酸减少，导致调节硫辛酸合成的基因上调。最终，减少的代谢物通过负反馈调节，增加调节TCA循环的基因表达。总之，通过有效生物膜穿透、自主生物膜内递送和CP在酸性BME中生成·OH，Motor@CP+NIR治疗增强细胞内铜（II）摄取并破坏TCA循环，最终导致细菌类铜死亡。

Motor@CP的体内抗生物膜活性

基于充分记录的生物膜消除能力和Motor@CP的特征机制，研究人员使用小鼠IABIs模型进行其抗生物膜活性的深入体内评估。首先，将预形成生物膜的PEEK垫圈植入小鼠背部颈部皮下建立IABIs模型。植入后，通过SEM观察植入物表面形成的生物膜。结果表明，在PEEK表面成功形成 well-developed 和致密生物膜。在10天治疗期间，连续监测皮下植入物周围皮肤组织。对照和Motor组 exhibit 明显炎症迹象，包括肿胀、脓液形成甚至植入物暴露或脱落，指示感染部位生物膜诱导的炎症反应。CP和Motor@CP组显示中等炎症迹象，而Motor@CP+NIR组 display 仅 mild 肿胀、 minimal 脓液或伤口化脓。值得注意的是，到术后第6天，Motor@CP+NIR组的感染区域显示显著减少，随后几天观察到一致下降， demonstrate 与对照相比 superior 体内抗生物膜活性。此外，由于感染，小鼠体重最初下降，但用Motor@CP+NIR处理的小鼠到第4天开始恢复体重。

不同处理后，通过确定CFU计数定量评估插入植入物上的细菌残留和周围组织中的浸润。SPM结果表明对照和Motor组中稳定菌落计数，表明对细菌存活力的最小影响。相反，在CP和Motor@CP组中观察到CFU计数适度减少，表明细菌存在一些减少。最显著的细菌负荷减少在Motor@CP+NIR组中 noted，其中CFU计数显著降低，突出该治疗的 superior 抗生物膜功效。这些发现通过SEM图像证实，显示与SPM数据的 clear 相关性。在Motor@CP+NIR组中，大多数细菌出现死亡和碎片化， intact 存活细菌细胞显著减少。该全面分析强调Motor@CP+NIR治疗的 potent 抗生物膜功效。

对感染部位周围组织进行组织形态学和定量分析。苏木精和伊红（H&E）染色显示对照、CP、Motor和Motor@CP组中 substantial 中性粒细胞浸润，指示与感染相关的 pronounced 炎症反应。相反，Motor@CP+NIR组中炎症显著减少并有效控制，表明成功调节炎症过程。吉姆萨染色进一步证实Motor@CP+NIR治疗在减少周围组织细菌浸润方面的更高功效。如图6j所示，虽然细菌浸润在对照、Motor、CP和Motor@CP组中 evident，具有 varying 程度的细菌簇和组织损伤，但Motor@CP+NIR组 demonstrate 细菌积累显著减少。该组中观察到的 minimal 细菌浸润 underscore Motor@CP+NIR治疗在限制细菌生存力和促进最佳愈合环境方面的 superior 功效。

常规血液测试，包括白细胞（WBC）、红细胞（RBC）、淋巴细胞和中性粒细胞的测量，显示对照、CP、Motor和Motor@CP组中显著升高的WBC、淋巴细胞和中性粒细胞计数，可归因于伤口中残留生物膜感染。相反，Motor@CP+NIR组显示炎症细胞计数显著减少，特别是中性粒细胞和淋巴细胞，反映体内IABIs的有效根除。此外，血液生化分析显示，所有治疗组中关键生物标志物水平保持在正常参考范围内，表明无显著肝或肾功能障碍。通过H&E染色对主要器官的组织学检查也显示任何组中无病变或组织损伤迹象。这些重要器官中缺乏组织病理学异常表明治疗未导致急性或慢性毒性， thereby 确认其体内应用的安全性。

免疫调节能力评估

进一步检查Motor@CP对巨噬细胞调节的影响。类似地，利用2.0 mm厚猪肉火腿片作为皮肤替代品以模拟临床场景。流式细胞术分析显示，Motor@CP+NIR显著促进RAW 264.7巨噬细胞向促炎M1表型，与对照相比增加8.1倍。鉴于免疫抑制BME由抗炎M2表型主导，研究人员进一步调查从抗炎M2到促炎M1表型的重编程效应。结果表明，Motor@CP+NIR组调节从CD206（M2巨噬细胞标记）到CD86（M1巨噬细胞标记）的转变，有效逆转免疫抑制BME并增强杀菌免疫反应。

进行免疫荧光染色以评估诱导型一氧化氮合酶（iNOS）的表达，M1极化的 well-established 标记。结果表明，Motor@CP+NIR处理的巨噬细胞 exhibit robust iNOS荧光，与流式细胞术结果 findings indicating M1极化一致。此外，研究使用酶联免疫吸附 assay（ELISAs）系统检查炎症因子的改变。结果显示，Motor@CP+NIR显著促进促炎细胞因子如TNF-α和IL-6的分泌，为激活促炎巨噬细胞介导的抗菌免疫反应提供证据。

在治疗过程的第5天，在小鼠IABIs模型中，感染引流淋巴结（IDLNs）在处死后采集。流式细胞术结果表明，Motor@CP+NIR显著增强促炎M1巨噬细胞极化。此外，收集感染区域周围组织，并进行免疫组织化学染色。TNF-α和iNOS在CP、Motor@CP和Motor@CP+NIR组中显著过表达， thereby 增强M1巨噬细胞迁移并恢复其杀菌潜力。此外，感染区域周围组织的ELISA assay 显示，促炎细胞因子TNF-α和IL-6在CP、Motor@CP和Motor@CP+NIR组中显著升高，而抗炎细胞因子IL-10和VEGF显著减少。 collectively，这些数据证明Motor@CP+NIR有效促进浸润巨噬细胞向促炎M1表型的免疫调节， thereby 增强抗菌免疫反应。此外，在感染后第10天，进行额外ELISA分析以验证对感染控制和组织修复的免疫调节效应。结果表明，Motor@CP+NIR成功根除生物膜感染，显著增强VEGF和IL-10的表达水平，并促进组织在抗IABIs治疗后期向修复过渡。

讨论

铜离子在环境中表现出相对稳定性， exhibit 抗分解同时保持一致的抗菌功效。然而，生物膜的致密结构显著阻碍细菌对铜离子的摄取，对当前基于铜的治疗构成 considerable 挑战。体外研究表明，常规铜供体如CuCl₂·2H₂O导致有限的细胞内铜离子积累，并与浮游细菌相比对生物膜效果降低，即使在 deemed 安全的浓度下。值得注意的是，栖息在生物膜庇护所内的细菌 display 异质生理活动以适应复杂BME， thereby 降低治疗功效并导致持续感染和复发。例如，位于生物膜更深处的细菌 demonstrate 减少代谢活动和对治疗剂 lower 敏感性 due to 氧气和营养物 access 受限。此外，保护性EPS基质屏蔽细菌免受某些抗生素、金属阳离子和宿主免疫防御，显著阻碍细菌清除并 continuously 促进免疫逃避。因此，克服致密生物膜屏障并广泛递送铜离子对于有效治疗IABIs至关重要。

超小CP纳米颗粒可同时分解为铜（II）和H₂O₂以响应酸性微环境。该过程进一步通过铜离子催化的类芬顿反应生成·OH。升高的·OH水平有助于破坏生物膜同时增强铜离子流入。体外实验证明CP处理部分增加细胞内铜离子摄取并在生物膜去除效率方面优于CuCl₂·2H₂O。这些发现表明CP纳米点可作为有希望的铜离子供体用于治疗生物膜相关感染。然而，在复杂和难治性IABIs背景下，CP单药治疗仍然受限于生物膜内