三维纳米纤维基质刚度调控细胞外囊泡 cargo 及其促肿瘤功能的作用机制

本研究通过构建仿生三维纳米纤维基质模型，首次系统揭示了细胞外基质刚度对细胞外囊泡生物物理特性、分子 cargo 及功能活性的调控作用。研究发现硬度基质衍生的 EVs 通过激活 MAPK/ERK1/2 信号通路显著增强肿瘤细胞的增殖迁移能力，为理解肿瘤机械微环境调控细胞间通讯提供了新视角。

三维纳米纤维基质刚度调控细胞外囊泡 cargo 及其促肿瘤功能

引言

细胞外基质的机械特性与细胞外囊泡是肿瘤进展的关键调控因子，然而它们在三维微环境中的相互作用尚不明确。现有研究多基于二维培养体系，难以模拟肿瘤微环境的复杂性。本研究开发了一种基于纤维素纳米纤维水凝胶的仿生三维ECM模型，旨在探究刚度依赖性EV特性及功能变化。

实验设计与基质表征

研究采用TEMPO氧化纤维素纳米纤维与明胶甲基丙烯酰胺构建混合水凝胶，通过405纳米紫外光交联形成稳定三维网络。傅里叶变换红外光谱显示TOCNF与GelMA之间存在氢键相互作用，力学测试表明软基质刚度为2千帕，硬基质达20千帕，模拟了正常与病理肺组织的刚度差异。溶胀实验显示两种水凝胶均具有良好的吸水性，扫描电镜证实其孔径主要分布在20-30微米范围内，酶降解实验验证了水凝胶的生物学可降解性。

生物相容性验证

通过钙黄绿素-AM/碘化丙啶染色评估H1299和A549细胞在三维水凝胶中的存活率，结果显示培养15天后细胞存活率仍维持80%以上。Edu染色显示细胞在两种刚度条件下均保持活跃增殖， Annexin V-FITC/PI凋亡检测证实凋亡水平较低。与纯GelMA水凝胶相比，TOCNF/GelMA混合水凝胶展现出更优的生物相容性。

EVs的物理特性调控

从7天三维培养体系中分离EVs，纳米颗粒追踪分析显示其粒径主要分布在100-200纳米。zeta电位分析发现软基质EVs表面电荷更负，原子力显微镜显示硬基质EVs的杨氏模量显著降低。Western blot检测到ERM蛋白和纽蛋白在软基质EVs中表达更高，提示基质刚度通过细胞骨架蛋白调控EV膜力学特性。

功能验证：体外与体内实验

划痕实验显示硬基质EVs处理组在24小时内的伤口闭合率显著提高，CCK-8实验证实其促进肿瘤细胞增殖。在裸鼠皮下移植瘤模型中，硬基质EVs处理组表现出更强的生物发光信号、更大的肿瘤体积和重量，肿瘤生长曲线显示其生长速率显著加快。

多组学机制探索

通过密度梯度离心结合尺寸排阻色谱纯化EVs，4D标记自由定量蛋白质组学鉴定出3965个共有蛋白，其中硬基质EVs中502个蛋白上调，165个下调。KEGG富集分析显示差异蛋白显著富集于MAPK、PI3K-Akt等信号通路。小RNA测序发现硬基质EVs中miR-1246和miR-1290等促癌miRNA显著上调，其靶基因富集于MAPK、Ras等通路。

信号通路验证

Western blot证实硬基质EVs处理可特异性激活ERK1/2磷酸化。使用U0126抑制剂处理可逆转硬基质EVs促进的细胞迁移和增殖现象，Transwell实验显示抑制剂处理组细胞迁移数减少60%，证实MAPK/ERK1/2通路的关键作用。

结论

本研究构建的三维纳米纤维基质模型成功揭示了基质刚度通过调控EVs的物理特性、分子cargo和信号通路激活状态，进而影响肿瘤进展的新机制。硬基质衍生的EVs通过富集特定蛋白和miRNA激活MAPK/ERK1/2通路，为靶向机械微环境的肿瘤治疗策略提供了理论依据。