细胞外囊泡表面配体修饰性能的定量解析：脂质、蛋白与膜插入策略对靶向效率的系统评估

本文系统评估了三种细胞外囊泡（EVs）表面工程策略（脂质修饰、蛋白修饰和膜插入）在配体偶联效率、分布均匀性及表面蛋白可及性方面的差异，通过纳米流式细胞术（nFCM）单颗粒分析揭示脂质修饰策略在配体密度（>10个/100 nm²）、均匀性和靶向性能方面的优势，为EVs靶向递送系统的理性设计提供了方法论支撑和实验依据。

1 引言

细胞外囊泡（EVs）作为细胞间通讯的关键介质，在纳米医学中展现出作为药物递送载体和独立治疗剂的巨大潜力。当前研究主要集中于哺乳动物细胞来源的EVs，其具有低免疫原性、高载货能力和功能可修饰性等优势。此外，源自牛奶等食物的EVs还具备可扩展性、成本效益、稳定性和生物安全性等特性。然而，EVs的靶向效率不足和非特异性细胞摄取可能降低其治疗效力并引起副作用。

为提高EVs的靶向性，多种表面工程策略被开发出来，包括抗体、肽段等细胞结合模块的修饰。这些策略可分为产前细胞工程和产后EV工程两大类。产前策略通过遗传或代谢标记方法在EV生成细胞中共表达功能分子，但大规模细胞培养和复杂操作限制了其应用，尤其对于体液和食品等非培养来源的EVs。产后EV工程则通过物理或化学方法对分离的EVs进行修饰，具有更通用、高效和成本效益高的特点。其中，膜插入法通过疏水相互作用将配体锚定分子（如磷脂、胆固醇）插入EV膜，但可能存在配体泄漏和胶束样纳米结构形成的问题。跨膜蛋白也可用于在EV表面展示功能分子，例如通过温和还原二硫键产生游离巯基，与马来酰亚胺封端的配体共价结合。然而，表面蛋白的修饰可能改变其天然结构和功能，影响EVs的生物分布和细胞相互作用。

尽管已有多种产后EV工程策略，包括靶向特定EV蛋白或利用胺反应化学的方法，但缺乏对不同策略配体偶联效率及对EV功能影响的系统评估。本研究聚焦于三种代表性产后EV工程策略：脂质修饰、蛋白修饰和膜插入，旨在定量评估其配体偶联性能及其与靶向效率的关系。

2 结果

2.1 不同产后EV工程策略的表面修饰

以牛奶来源的EVs（mEVs）为模型，使用绿色荧光蛋白（GFP）作为代表配体，应用三种方法进行配体偶联。脂质修饰利用链霉菌磷脂酶D（sPLD）催化磷脂酰基转移反应，将马来酰亚胺基团引入EV表面，再与巯基化GFP共价结合。蛋白修饰通过三(2-羧乙基)膦（TCEP）温和还原EV表面蛋白的二硫键，产生巯基用于与马来酰亚胺修饰的GFP结合。膜插入则将马来酰基功能化的聚乙二醇化磷脂（DSPE-PEG-MAL）通过疏水相互作用掺入EV双层膜，再与巯基化GFP共价结合。

凝胶过滤色谱（GFC）显示，所有三种方法均能有效实现GFP偶联，膜插入和脂质修饰比蛋白修饰保留更多配体。透射电子显微镜（TEM）证实修饰后mEVs结构完整性得以保持。比较评估表明，脂质修饰的荧光强度随sPLD浓度增加而增加，在1–10 U/mL范围内实现最有效的GFP偶联；蛋白修饰的荧光强度在较高TCEP浓度下下降，可能由于过度还原导致mEV完整性破坏或聚集；膜插入则显示荧光强度与DSPE-PEG-MAL浓度正相关。

纳米颗粒跟踪分析（NTA）和动态光散射（DLS）表明，脂质修饰和膜插入未显著改变mEVs的粒径和zeta电位，而蛋白修饰在TCEP浓度高于5 mM时粒径增加，可能与聚集有关。

2.2 基于nFCM的配体偶联密度单颗粒定量

利用纳米流式细胞术（nFCM）在单颗粒水平定量配体偶联密度。通过侧向散射（SS）和GFP荧光信号的相关性，快速分析不同修饰方法和条件下的GFP偶联效率。使用已知尺寸的二氧化硅纳米颗粒（SiNPs）作为校准标准，从SS强度推导尺寸分布。nFCM测得的直径明显小于NTA，主要因NTA灵敏度有限，无法检测约60 nm以下的最暗囊泡，使数量加权分布偏向更大、散射更亮的颗粒。

使用荧光SiNPs作为参考，通过已建立的nFCM分析方法定量单个mEVs上偶联的GFP分子数。脂质、蛋白和膜策略的中位GFP拷贝数分别为1388、485和229 per EV，中位直径分别为72、69和68 nm，均比空白mEVs大约5 nm。将GFP计数归一化到每个mEV的表面积（由其尺寸计算），确定配体密度（即每单位表面积的GFP分子数）及其分布。脂质和蛋白修饰的mEVs-GFP显示相对狭窄、类高斯分布，表明颗粒间配体偶联均匀。

偶联比率（GFP阳性mEVs的百分比）比较显示，脂质修饰和膜插入的偶联比率随浓度增加而增加，在较高sPLD或DSPE-PEG-MAL浓度下平台化；蛋白修饰在TCEP浓度超过5 mM时急剧下降。在最佳条件下，所有三种方法中超过80%的mEVs为GFP阳性，脂质修饰在sPLD浓度超过1 U/mL时达到最高偶联比率（约95%）。配体密度也呈现浓度依赖性模式：脂质修饰在最佳条件下配体密度约为10个分子每100 nm²，高于膜插入（约2个分子每100 nm²）；蛋白修饰在TCEP浓度高于2 mM时GFP偶联密度急剧增加至超过20个分子每100 nm²，但伴随SS强度意外增加，表明mEVs聚集。

整体平均方法也用于估计GFP偶联程度。通过荧光标准曲线量化mEV-GFP样品中的总GFP含量，结合nFCM确定的颗粒浓度，计算每个mEV偶联的平均GFP分子数。冷冻TEM用于确定mEVs的平均表面积。基于每个mEV偶联的GFP分子数和单个mEVs的表面积，计算平均GFP修饰密度。验证配体密度定量时，比较nFCM和整体分析结果：脂质修饰的GFP密度在两种方法间一致；蛋白修饰在偶联水平高时nFCM与整体比率显著降低，可能因高TCEP浓度引起mEVs部分裂解，导致颗粒浓度降低；膜插入的不一致可能因样品中存在GFP偶联的DSPE-PEG-MAL胶束，整体分析无法将其与mEVs-GFP区分，导致高估平均GFP修饰 per mEV。

为验证表面工程和GFP偶联不损害囊泡完整性，在几种常见应激条件下监测对照mEVs和三种工程化mEV-GFPs。在4°C 14天和三次冻融循环后，平均直径、荧光强度和GFP阳性囊泡百分比基本不变，颗粒浓度仅适度下降，且所有组下降程度相似，表明轻微损失不是由表面修饰或GFP标记引起。此外，在37°C PBS或小鼠血清中孵育24小时未引起尺寸、浓度、荧光强度或标记效率的显著改变。这些结果表明所有三种工程策略产生的mEV-GFPs具有优异的稳定性，适用于短期储存、处理和后续体内应用。

2.3 mEVs-GFP表面配体分布均匀性评估

除配体密度外，配体在EVs表面的空间分布对高效细胞结合至关重要。均匀配体分布增强纳米材料靶向效率，而异质分布阻碍与细胞的多价相互作用。为研究GFP的表面配体分布均匀性，开发了基于nFCM的荧光共振能量转移（FRET） assay，使用固定比例的GFP（供体）和mCherry（受体）混合物作为代表配体。

在相等配体浓度下，通过脂质修饰、蛋白修饰和膜插入方法制备双偶联mEVs（mEVs-GFP&mCherry）。这些样品的吸收光谱显示，三种制备方法的总GFP和mCherry量几乎相同。不同比例GFP和mCherry的标准混合物用于建立标准曲线，将其混合比与相对吸收值关联，确认所有样品的GFP与mCherry标记比率一致为2.6:1。这种一致性确保FRET信号反映表面配体分布均匀性的差异，而非荧光蛋白量或比例的变化。

随后，通过nFCM测量单个mEVs的FRET信号，使用仅GFP的mEVs作为对照数学校正荧光溢出。使用两个参数评估FRET效率：mCherry阳性与GFP阳性颗粒的比例和mCherry与GFP荧光强度比。这些参数值越高表明mEV表面GFP和mCherry分子的空间接近或聚类程度越高，值越低表明配体分布更均匀或分散。结果表明所有三种方法制备的mEVs-GFP&mCherry均成功实现能量转移，在488 nm激光激发下检测到mCherry荧光。三种修饰方法中，脂质修饰的mEVs-GFP&mCherry显示最低FRET效率，表明mEV表面配体分布更均匀；蛋白修饰样品显示显著更高的FRET效率，可能因GFP和mCherry在蛋白富集区域局部聚类，其他表面区域无配体；膜插入组显示突出的FRET信号，可能因DSPE-PEG-MAL掺入不均，导致异质配体偶联。

nFCM确认不同方法工程的mEVs-GFP&mCherry颗粒浓度和尺寸一致，表明所有方法在应用修饰条件下未引起mEVs聚集或裂解。在相同检测设置下，仅mCherry偶联的mEV样品（mEVs-mCherry）中观察到可忽略的荧光信号，进一步确保观察到的FRET现象 solely归因于表面配体分布均匀性的差异，而非mCherry的直接激发。此外，表面活性剂裂解后mCherry荧光的显著下降为FRET提供了另一证据，因mEV完整性破坏导致GFP和mCherry稀释和分离，消除其空间接近性。

为验证这些发现，进行高分辨率受激发射损耗（STED）显微镜观察用膜染料DiI标记的单个mEVs-GFP的配体分布。在最佳修饰条件下，所有三种方法的GFP分布相对均匀，但详细检查揭示GFP分布的囊泡内和囊泡间异质性。值得注意的是，高TCEP浓度下的蛋白修饰引起mEV聚集，STED图像中可见聚类mEVs，与nFCM结果一致。膜插入组中，一部分颗粒显示GFP荧光而无相应DiI信号，表明存在GFP偶联的DSPE-PEG-MAL胶束而非完整mEVs。这些发现强化了nFCM基于FRET assay的定量结果，强调了不同修饰策略对表面配体分布均匀性的影响。

2.4 配体偶联对mEVs表面蛋白可及性的影响

广泛认可表面蛋白显著贡献EVs的多种功能，包括独特的细胞相互作用和生物分布谱。配体偶联由于直接空间位阻效应和潜在蛋白构象改变，可能损害EV表面关键蛋白的可及性，从而改变其功能。为评估不同表面修饰策略对EV表面蛋白可及性的影响，进行免疫荧光分析靶向两个特征蛋白CD9和CD63，使用nFCM。

蛋白修饰和膜插入方法导致CD9和CD63标记比率不同程度降低，而脂质修饰未显示显著下降。进一步分析具有不同配体密度的mEVs-GFP：脂质修饰制备的mEVs-GFP的CD9和CD63标记比率保持不变，即使在高配体密度下，表明脂质基偶联对表面蛋白可及性影响微小；蛋白修饰和膜插入工程的mEVs-GFP观察到配体密度依赖性下降的免疫标记比率，表明CD9和CD63可及性受损。膜插入制备的样品显示最低标记比率，可能归因于PEG部分的空间屏蔽效应。荧光标记的IgG同型对照确认观察结果非由非特异性抗体结合引起。

鉴于CD9和CD63标记效率不理想，探测另一个代表mEV跨膜蛋白MFGE8，使用Alexa Fluor 647标记的MFGE8抗体（anti-MFGE8-AF647）进一步确认配体偶联对表面蛋白可及性的影响。通过nFCM确定单个mEVs的GFP荧光和MFGE8免疫荧光之间的关系，揭示不同偶联方法间的显著变异。空白mEVs的MFGE8免疫标记比率高于90%，表明MFGE8是mEV识别的合适标记。然而，所有GFP修饰样品的免疫荧光强度和MFGE8阳性颗粒比例均显著降低于空白mEVs。对于具有可比GFP荧光强度的mEVs-GFP，脂质修饰显示MFGE8免疫荧光强度和MFGE8阳性颗粒比率下降最小，蛋白修饰显示最显著下降。

利用nFCM的多参数定量检测能力，进一步量化单个颗粒上GFP和anti-MFGE8-AF647的荧光强度密度（每单位表面积），揭示其相关性。脂质修饰样品中，anti-MFGE8-AF647的荧光强度密度保持一致，即使GFP的荧光强度密度增加；蛋白修饰和膜插入样品显示anti-MFGE8-AF647荧光强度密度随GFP荧光强度密度增加而显著降低，膜插入显示最 substantial下降。这些结果表明蛋白修饰可能通过直接将GFP附着到表面蛋白而空间阻塞MFGE8结合位点，从而降低其可及性；膜插入则通过PEG化引入 substantial空间屏障，可能进一步限制MFGE8可及性。

2.5 转铁蛋白偶联mEVs的配体密度依赖性细胞摄取

选择转铁蛋白作为生理相关靶向配体，阐明不同偶联策略和配体密度如何影响mEVs的细胞摄取。为促进成像和定量，mEVs首先用荧光染料DiD标记，随后通过三种不同方法将转铁蛋白偶联到mEV表面。将转铁蛋白偶联的mEVs（mEVs-Tf）与HepG2细胞孵育，探索配体偶联方法与细胞摄取之间的关系。

共聚焦荧光显微镜显示，转铁蛋白偶联显著增强mEV与靶细胞的结合，无论使用何种修饰方法。与游离转铁蛋白的竞争结合实验表明增强的细胞摄取是配体依赖性的。共聚焦荧光显微镜还显示mEVs-Tf与溶酶体的显著共定位，表明配体-受体介导的内吞途径。Manders分析确认：M1（与LysoTracker重叠的DiD-mEVs荧光分数）和M2（与DiD-mEVs重叠的LysoTracker荧光分数）在转铁蛋白偶联后均增加，与典型Tf-受体摄取途径一致。

为探索配体密度对细胞摄取的影响，mEVs与CF488标记的转铁蛋白（mEVs-Tf-CF488）通过三种偶联方法偶联。通过nFCM揭示颗粒尺寸与每个颗粒转铁蛋白数量的关系。所有偶联方法实现效率超过90%，平均每个mEV附着数百个转铁蛋白分子。随后，制备具有不同转铁蛋白密度的mEVs-Tf-CF488。解释转铁蛋白浓度与mEVs-Tf-CF488的偶联比率和配体密度之间的相关性：配体浓度超过10 µM时，所有方法的偶联比率超过80%，脂质修饰达到最高配体密度。转铁蛋白的最大密度（约2.9个分子每100 nm²）低于GFP偶联对应物，可能因转铁蛋白尺寸更大（约80 kDa）相对于GFP（约27 kDa）。

为定量评估配体偶联对细胞摄取的影响，制备DiD标记的mEVs-Tf-CF488并与HepG2细胞孵育。使用常规流式细胞术（FCM）以DiD荧光为指示剂量化细胞摄取。整合nFCM数据 enable配体浓度/密度与细胞摄取之间关系的详细分析。证明脂质修饰制备的mEVs-Tf-CF488 exhibit最显著的配体密度依赖性细胞摄取增加；蛋白修饰的细胞摄取程度最初随配体密度增加，但当Tf-CF488密度超过1.1个分子每100 nm²时下降；膜插入的摄取随配体密度逐渐增加，在约1.4个分子每100 nm²时平台化。这些发现强调配体密度和偶联方法在调节EVs细胞摄取中的关键作用。值得注意的是，即使在可比配体密度下，三种偶联策略间观察到细胞摄取程度的显著差异。

2.6 表面蛋白可及性和配体分布均匀性对细胞摄取程度的影响

为阐明为何具有可比转铁蛋白密度的mEVs exhibit varying细胞摄取效率，进一步研究内在表面蛋白和配体分布均匀性的作用。先前研究表明mEVs自然拥有 exceptional细胞结合能力，表面蛋白被广泛认为是关键贡献者。其中，MFGE8因其整合素结合基序（包括RGD结构域）和在mEV膜上的高表达水平而显著，表明MFGE8对mEVs的内在靶向能力 pivotal。

优化转铁蛋白偶联可通过利用MFGE8的内在结合特性和转铁蛋白与其受体之间的特异性相互作用协同增强细胞摄取。相反，不适当的转铁蛋白偶联，如异质修饰或将配体锚定到MFGE8的功能表位，可能损害mEVs的内在细胞结合能力或产生空间位阻，最终降低转铁蛋白介导的摄取效率。

为验证MFGE8在mEV-细胞相互作用中的作用，mEVs在细胞孵育前用MFGE8抗体预标记，导致细胞摄取与未处理mEVs相比显著减少（>50%），强调MFGE8对mEVs固有细胞结合能力的 substantial贡献。为研究转铁蛋白偶联如何影响MFGE8可及性，使用nFCM基于免疫标记测量MFGE8标记比率和荧光强度的变化。未修饰mEVs exhibit高MFGE8标记比率，与上述发现一致；转铁蛋白偶联降低标记比率，降低程度取决于偶联策略。三种策略中，脂质修饰对MFGE8免疫标记影响最小，表明对其功能影响相对最小。这种有限影响促进转铁蛋白和内在MFGE8之间的协同相互作用，从而增强mEVs的细胞摄取效率。相反，蛋白修饰和膜插入导致MFGE8可及性更显著降低。对EV表面蛋白的更大影响可能削弱MFGE8整合素结合能力提供的协作效益，从而降低整体细胞摄取效率。

除MFGE8等表面蛋白的可及性外，配体偶联过程也影响表面配体分布均匀性，进一步影响mEVs的细胞摄取效率。利用开发的基于FRET的方法，进行比较分析评估转铁蛋白在mEVs上的表面配体分布均匀性。使用相等浓度的CF594标记转铁蛋白（Tf-CF594）和CF488标记转铁蛋白（Tf-CF488）作为供体/受体对，使用不同修饰方法制备三种具有可比配体密度的双偶联mEVs（mEVs-Tf-CF488&Tf-CF594）。分析CF488和CF594之间的相关荧光信号，以及通过nFCM的Tf-CF488仅偶联对照。补偿CF488在CF594通道中的荧光溢出后，计算CF594阳性与CF488阳性颗粒的比率和相对荧光强度（CF594/CF488）。脂质修饰显示较低的CF594阳性颗粒比率和较弱FRET信号（FL-CF594/FL-CF488），表明更均匀的表面配体分布；蛋白和膜基偶联方法产生更大的表面配体分布异质性，反映于更高FRET效率。分析Tf-CF594仅偶联mEVs确认在488 nm激发下检测到可忽略CF594信号，验证双偶联制剂中观察到的CF594信号源于FRET而非直接激发。这些发现表明表面配体分布均匀性可能 contribute观察到的不同方法制备mEVs-Tf细胞摄取效率差异，与先前在脂质体中的发现一致，其中不均匀配体分布 greatly损害细胞结合能力。

collectively，配体偶联mEVs的细胞摄取效率不仅由配体密度控制，还受表面蛋白可及性和配体分布均匀性支配。测试策略中，脂质修饰作为mEVs最有效方法出现，保留MFGE8功能并促进均匀配体分布，从而 enable协同高效细胞靶向。

2.7 mEVs-Tf的体内癌症靶向

尽管主动靶向策略在增强纳米材料细胞摄取方面证明有效，体内性能通常不如预期，限制其临床应用。因此，评估DiD标记mEVs-Tf的生物分布和癌症靶向效率，选择每种方法基于体外细胞靶向功效的最有效制剂。使用肿瘤携带小鼠模型，观察到mEVs-Tf在不同时间点显示比空白mEVs更强烈的肿瘤区域荧光。值得注意的是，脂质修饰工程的样品显示最显著肿瘤积累，可能 owing配体密度更高、表面配体分布更均匀、对MFGE8等表面蛋白可及性破坏更少的优点。主要器官和肿瘤的离体成像显示mEVs主要积累在肝脏、脾脏和肿瘤组织。与体内观察一致，肿瘤相关信号表明转铁蛋白偶联显著改善mEVs的癌症靶向能力，脂质修饰方法显示最显著效应。

静脉注射后，血清蛋白如IgG和IgM吸附到纳米颗粒表面可引起粒径和表面性质改变，导致 altered生物分布谱。对于修饰有肿瘤靶向模块的EVs，这种蛋白吸附可能干扰配体与靶分子结合，从而降低肿瘤靶向功效。为评估小鼠血清孵育后免疫球蛋白在mEVs上的潜在吸附，进行IgG和IgM免疫荧光染色。点图关联粒径和IgG及IgM免疫荧光强度显示IgM比IgG更突出吸附到mEV表面，无论转铁蛋白偶联。这种IgM相对于IgG的优先吸附可能归因于裸鼠血清中IgM水平更高及其在免疫响应初始阶段更 robust作用。值得注意的是，无论转铁蛋白偶联，每种制备包含两个可辨别亚群：IgG/IgM阳性囊泡 alongside IgG/IgM阴性囊泡。这种异质性最可能根源于mEVs的混合细胞来源（乳腺上皮、常驻免疫和血液来源细胞），这赋予个体囊泡 distinct表面脂质和聚糖模式以及Fc或补体结合蛋白可变水平，导致血清免疫球蛋白 distinct吸收行为。重要的是，nFCM确认血清中颗粒浓度约4.7 × 10⁷ particles/mL（<1% mEVs），从而排除血清来源污染物作为观察到的IgG/IgM结合亚群的贡献者。

标记比率和免疫荧光强度进一步显示膜插入工程的mEVs-Tf exhibit最高血清蛋白吸附，尤其对于IgM，相对于其他两种方法。更显著吸附可能因膜插入过程中引入PEG，因PEG化已知引起免疫响应增加IgM结合。有趣的是，蛋白基配体偶联减少血清吸附，可能通过改变mEV表面特定牛奶蛋白的免疫原性，从而降低其对血清蛋白吸附的敏感性。血清孵育后mEVs的尺寸增加进一步验证蛋白吸附过程。使用未血清孵育mEVs的对照实验验证荧光信号主要归因于吸附IgG或IgM与相应抗体之间的特异性结合。

此外，进行ELISA assay评估血清孵育后mEV偶联转铁蛋白的可及性。结果显示血清孵育后所有三种方法制备mEVs-Tf的ELISA检测转铁蛋白浓度下降，因血清蛋白吸附。膜插入样品显示最 substantial下降，而脂质修饰方法证明最小配体损伤，与nFCM检测到的严重血清蛋白吸附一致。总体，这些发现表明对于特定配体-受体系统，不同配体偶联策略可能导致 varying配体偶联性能，最终影响EVs的体内肿瘤靶向功效。

3 讨论

3.1 开发多样化产后EV工程策略的基本原理

当前最流行的EVs配体偶联方法涉及配体与指定“支架”蛋白在EV表面的共表达。这种内源表达策略提供 several优势，包括能够展示否则难以或昂贵生产的蛋白质或肽，确保配体受控取向和适当暴露，并允许某些生物活性模块在EV腔内呈现。然而，它在识别合适支架蛋白方面提出巨大挑战，这些蛋白需在EVs上高表达、尺寸相对较小、提供配体附着的适当工程位点、缺乏 substantial生物活性且不损害EV稳定性。

相比之下，本研究聚焦产后EV工程策略， specifically脂质修饰、蛋白修饰和膜插入，依赖于分离EVs上的 straightforward化学连接。这些产后EV工程方法为EVs提供快速、可扩展和成本效益高的配体偶联。它们特别适用于非培养细胞来源的EVs，如植物、血液、牛奶和其他生物流体，其中内源工程具有挑战性或不可行。我们的调查证明所有三种产后EV工程策略在优化条件下实现高偶联效率（>90%）和配体密度（每个mEV数百至数千配体）。其中，脂质修饰 exhibit最高效率、更均匀表面配体分布和最小表面蛋白功能影响，至少在检查的mEV系统范围内。

然而，值得注意的是，不同来源的EVs具有 distinct组成，需要定制产后EV工程策略以实现最佳配体偶联。例如，低磷脂酰胆碱含量的植物来源EVs可能限制磷脂锚定配体偶联的功效，而具有显著脂蛋白或其他蛋白污染物的EVs较不适合蛋白基偶联，可能引起脱靶修饰。此外，膜插入方法需谨慎，因过量添加功能化脂质或配体可能导致胶束形成或配体分布不均匀，使后续表征复杂化或损害EV完整性和靶向性能。

重要的是要承认，尽管我们聚焦靶向不同EV组件（磷脂或表面蛋白）或引入外源脂质用于膜插入的三种代表策略，每种策略内存在众多变体。例如，替代蛋白修饰工具、 distinct膜插入分子和多样偶联化学也适用于EV工程。这些修饰中的每一个最终可能影响配体偶联性能和 resulting靶向功效，可能需要逐案调查以探索它们对不同EV来源和应用的具体影响。

3.2 配体偶联性能评估的重要性

配体偶联性能的精确评估是确保纳米颗粒靶向递送成功的基本前提，但常被忽视。这对EVs尤其关键，其 exhibit显著内在异质性。传统整体分析无法捕捉EVs的异质特性，尤其配体偶联引入的广泛变异性。通过整合nFCM基于定量、FRET assays和免疫荧光标记，我们的研究先进 beyond仅确认配体存在。我们量化表面配体分布均匀性，评估其对表面蛋白的影响，并映射不同产后EV工程策略如何在分子水平影响EV表面。

与合成脂质体不同，我们先前研究显示受控但仍可变配体密度分布，EVs呈现更复杂跨越多方面配体偶联性能的异质性。此外，我们的研究阐明配体偶联与细胞摄取之间的相关性。发现每100 nm² 1至几个转铁蛋白分子的偶联可有效增强EVs被靶细胞内在化。这表明，与病毒表面抗原类似，优化EVs上配体密度对有效受体接合至关重要。

然而，实现最佳靶向涉及不仅仅控制配体密度。我们基于FRET的分析