关联电压成像与冷冻电子断层扫描技术桥接神经元电活动与分子结构的研究

本研究开发了关联电压成像与冷冻电子断层扫描(CoVET)技术，成功解决了神经元电生理特性与高分辨率分子结构难以直接关联的难题。研究人员通过对海马神经元进行电生理特性分类和单细胞引导的结构分析，发现不同电生理簇的核糖体呈现显著差异的翻译景观和空间网络特征。该技术为研究神经元功能与分子结构的关联提供了新范式，对理解神经可塑性及相关疾病机制具有重要意义。

大脑中不同类型的神经元通过精密协作实现认知和记忆等复杂功能。这些神经元表现出多样化的电生理特性，这些特性由其分子特征决定，并通过电信号相互通信来介导网络层面的神经计算。然而，神经元电活动与分子结构之间的直接关联一直是神经科学领域的重大挑战。传统的荧光标记方法虽然能够定位特定蛋白质或细胞器，但无法准确反映异质性神经元的电生理特性，这可能导致整合不同电生理特性神经元信息时产生偏差。

为了解决这一技术瓶颈，来自首尔国立大学的研究团队在《Nature Communications》上发表了题为"Correlative voltage imaging and cryo-electron tomography bridge neuronal activity and molecular structure"的研究论文，开发了一种名为关联电压成像和冷冻电子断层扫描(CoVET)的新技术。该技术的创新之处在于将电压成像的非破坏性特性与冷冻电子断层扫描(cryo-ET)的高分辨率成像能力相结合，实现了神经元电生理特性与分子结构的直接关联。

研究人员首先优化了神经元培养条件，设计了特殊的网格支架实现低密度培养，确保单个神经元的清晰识别。通过电压敏感探针BeRST1和电场刺激，他们对网格上的所有神经元进行快速电生理特性筛查，并根据动作电位峰值、衰减参数和可重复性三个参数将神经元分为强响应、中等响应和无响应三个簇。

电压成像后15分钟内完成玻璃化冷冻，通过冷冻聚焦离子束/扫描电子显微镜(cryo-FIB/SEM)针对不同电生理簇的神经元胞体进行精准减薄，然后进行冷冻电子断层扫描成像。研究人员共分析了来自三个簇的193个断层扫描图像，识别出31,389个核糖体颗粒，获得了分辨率为7.8Å的一致结构图。

主要技术方法

研究采用大鼠海马原代神经元与星形胶质细胞共培养体系，通过定制网格支架实现低密度培养。使用电压敏感探针BeRST1进行全网格电压成像，结合电场刺激评估神经元电生理响应。通过分级聚类分析将神经元分为三个功能簇，利用冷冻聚焦离子束/扫描电子显微镜针对不同簇的神经元进行定位减薄，最后通过冷冻电子断层扫描获得高分辨率结构数据。

Translational landscapes of ribosomes in different clusters

通过对不同电生理簇神经元中核糖体的结构分析，研究人员发现了显著的差异。强响应簇的神经元显示出更高比例的处于解码1状态的核糖体，而中等响应和无响应簇的分布则有所不同。更重要的是，核糖体间的空间排布分析显示，强响应簇的神经元中核糖体间距在9nm处出现明显峰值，这是多聚核糖体的典型特征，表明翻译活动更为活跃。

Correlation of voltage imaging to cryo-ET

研究人员建立了完整的关联工作流程，将宽场荧光蒙片与冷冻扫描电镜蒙片精确配准，成功实现了92.6%神经元的电生理信息传递。通过集成荧光显微镜(iFLM)验证了细胞核定位，为后续的结构分析提供了精确定位基础。

Voltage imaging characterizes and classifies the electric responses of individual neurons on grids

电压成像结果显示，网格上的神经元对电场刺激表现出高度异质性的响应特征。从一致的动作电位到微弱、不规则或完全无响应，神经元的电生理特性在样品制备批次间和同一网格内的个体神经元间都存在显著差异。这种异质性凸显了基于电生理特性的单细胞分析的重要性。

Preparing primary neuron for effective CoVET analysis

通过优化培养条件，研究人员实现了适于光学和电子显微镜分析的低密度神经元培养。三明治培养法的引入显著促进了神经突的生长，确保了神经元在网格上的正常功能发育。

研究结论表明，CoVET技术成功建立了神经元电生理特性与分子结构之间的直接联系。不同电生理响应特性的神经元在核糖体翻译景观和空间网络组织上表现出显著差异，强调了基于电生理学的单细胞冷冻电子断层扫描在神经元研究中的重要性。尽管目前技术在小膜蛋白复合物可视化方面仍存在限制，但随着成像技术的进步，CoVET技术有望在更广泛生物学系统中揭示电生理特性与分子结构的内在联系。

该研究的创新之处在于首次将电压成像与冷冻电子断层扫描技术有机结合，为理解神经元功能与分子结构的关联提供了强有力的工具。这种多模态关联成像方法不仅适用于神经元研究，还可推广至其他生物系统，结合新兴技术进一步揭示神经可塑性、学习记忆乃至神经退行性疾病的分子机制。

研究人员也指出了技术的当前局限性，包括电场刺激的空间异质性、神经元成熟度和网络连接性等影响因素，以及对小膜蛋白复合物成像的技术挑战。未来通过结合突触阻断剂、开发死后荧光分析方法和提高冷冻电子断层扫描通量，CoVET技术将能更精确地解析分子与电生理表型之间的联系。

这项由Mingyu Jung和Gwanho Ko作为共同第一作者，Myunghwan Choi和Soung-Hun Roh作为共同通讯作者的研究，为神经科学领域提供了一种强大的新工具，有望推动对神经元功能与结构关系的深入理解。