揭示果糖代谢酶KHK-A/C介导酒精偏好与酒精性肝病的共同机制

本刊推荐：为解决酒精使用障碍（AUD）和酒精性肝病（ALD）的发病机制问题，研究人员开展酒精通过激活多元醇通路诱导内源性果糖生成并依赖KHK-A/C（酮己糖激酶）代谢驱动酒精摄入和肝损伤的主题研究。发现阻断KHK-A/C可降低酒精偏好和摄入，并防止ALD进展，其意义在于为AUD和ALD治疗提供了新靶点。

酒精和糖不仅共享令人愉悦的强化特性，还会导致相似的肝脏疾病进展，最终引发肝硬化。近年来，科学家们发现了一个有趣的现象：乙醇能够激活醛糖还原酶（AR）通路，导致内源性果糖的产生。这不禁让人思考，是否酒精的偏好性和它引发的肝病，背后都与果糖代谢有着千丝万缕的联系？

为了回答这个问题，一项发表在《Nature Metabolism》上的研究深入探讨了果糖代谢的关键酶——酮己糖激酶（KHK-A/C）在酒精摄入和酒精性肝病（ALD）中的作用。研究人员利用全身性、条件性和组织特异性KHK-A/C基因敲除小鼠，系统评估了乙醇消耗、强化行为以及肝损伤情况。

研究发现，乙醇消耗会增加门静脉渗透压，并激活肝脏和肠道中的多元醇通路，导致果糖生成，而这些果糖正是由KHK-A/C负责代谢的。缺乏KHK-A/C的小鼠在多种实验范式（包括双瓶选择、条件性位置偏好和操作性自我给药）中均表现出乙醇偏好降低，同时伏隔核中的ΔFosB表达减少。无论是基因删除还是药理抑制KHK-A/C，都能有效抑制乙醇摄入。

具体到组织层面，肝细胞特异性KHK-A/C敲除小鼠的酒精消耗量部分减少，这可能与乙醛脱氢酶（ALDH）表达改变有关；而肠道特异性KHK-A/C删除则恢复了胰高血糖素样肽-1（GLP-1）的水平——这是一种已知能抑制酒精摄入的激素。在乙醇配对喂养条件下，全身性和肝脏特异性KHK-A/C敲除小鼠均受到保护免于发生ALD，表现为肝脏脂肪变性、炎症和纤维化的显著减轻。

这些发现共同表明，乙醇诱导的果糖代谢是过度酒精消费和ALD发病机制的关键驱动因素。鉴于ALD和代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD）共享果糖依赖的机制，靶向果糖代谢可能为治疗酒精使用障碍及相关肝损伤提供新的治疗策略。

主要技术方法

研究采用全球及组织特异性基因敲除小鼠模型（包括KHK-A/C^-/-、肝细胞特异性Alb-Cre和肠道特异性Vil1-Cre小鼠），通过长期（30周）双瓶选择实验和行为学测试（条件性位置偏好和操作性自我给药）评估酒精偏好。利用蛋白质印迹、酶活性测定和质谱分析检测分子表达和代谢物水平。通过组织学分析（H&E和天狼星红染色）和生化检测（肝功能酶、甘油三酯和羟脯氨酸含量）评估肝损伤程度。使用选择性KHK抑制剂CRP427进行药理学验证。

乙醇偏好依赖于果糖代谢

研究人员首先发现，乙醇暴露显著增加了小鼠肝脏中KHK-A和KHK-C异构体的mRNA水平，同时提高了肝脏和肠道中的KHK蛋白表达和酶活性。在全身性KHK-A/C敲除小鼠中，乙醇诱导的KHK激活完全缺失，而仅缺失KHK-A异构体的小鼠则表现正常，表明乙醇主要通过激活KHK-C异构体发挥作用。

在行为学实验中，KHK-A/C敲除小鼠表现出对乙醇的偏好和摄入量显著降低，这一现象在雄性和雌性小鼠中均得到验证。条件性位置偏好测试进一步显示，KHK-A/C敲除小鼠对乙醇相关环境的偏好转移减弱，表明乙醇的奖赏效应降低。虽然小鼠的运动活动在生理盐水注射后没有显著差异，但在乙醇注射后，KHK-A/C敲除小鼠在最初10分钟内的活动量增加，这可能反映了其对乙醇的行为反应发生了改变。

在分子层面，乙醇处理的野生型小鼠伏隔核中ΔFosB及其下游靶基因（Glur2和Cdk5）的表达增加，而KHK-A/C敲除小鼠则没有出现类似变化。这表明，要么KHK-A/C小鼠摄入的乙醇不足以触发这些神经适应性反应，要么它们对乙醇诱导的分子信号传导本质上就不敏感。

乙醇刺激内源性果糖生产和代谢

研究表明，乙醇的主要果糖转运蛋白GLUT5在肝脏和小肠中的表达并未因乙醇暴露而改变，提示果糖积累很可能源于内源性生成而非肠道吸收增强。乙醇作为一种高渗化合物，其渗透特性可能是刺激内源性果糖生产的诱因。

实验证实，乙醇以剂量依赖的方式显著增加门静脉渗透压。当乙醇以更稀释的形式给药时，渗透压的升高明显减弱，突出了乙醇渗透效应的浓度依赖性。此外，连续四天每日两次口服未稀释的乙醇会导致肝脏AR蛋白表达显著增加，而稀释乙醇则无此效果，表明乙醇的高渗性是驱动AR诱导和后续多元醇通路激活的关键。与此机制一致，乙醇暴露导致肝脏山梨醇和果糖水平呈剂量依赖性增加，支持了乙醇通过渗透介导的多元醇通路激活促进内源性果糖生产的假说。

AR敲除小鼠的乙醇偏好和消耗减少

为了评估内源性果糖生产对乙醇相关行为的贡献，研究人员检测了AR敲除（ARKO）小鼠的行为。AR杂合子动物表达中等水平的AR，为评估潜在的基因剂量效应提供了机会。

使用双瓶选择范式的评估结果显示，AR表达与乙醇消耗量之间存在剂量依赖关系，特别是在乙醇浓度超过6%时。虽然先前的研究已证实AR的药理抑制可以预防ALD，但AR在调节乙醇偏好和摄入中的作用此前尚未在AR缺陷小鼠中进行评估。数据表明，在30周的时间内，ARKO小鼠的每日和累积乙醇摄入量均显著低于杂合子和野生型对照组，这支持了多元醇通路激活以及内源性果糖生产在强化乙醇消费中的关键作用。

肝脏果糖代谢在调节乙醇偏好和摄入中的作用

为了阐明该通路在乙醇偏好中的组织特异性贡献，研究人员使用了肝脏或肠道特异性删除KHK-A/C的小鼠。将全身性KHK-A/C敲除小鼠与肝脏特异性KHK-A/C敲除小鼠（Khk^fl/fl × Alb1-cre）及其对照同窝小鼠（Khk^fl/fl）在双瓶选择测试中进行比较。结果显示，Khk^fl/fl × Alb1-cre小鼠相对于对照组表现出显著降低的乙醇偏好，导致在30周的研究期间乙醇摄入量减少。尽管减少程度不如全身性KHK-A/C敲除小鼠那么明显，但这些发现强调了肝脏果糖代谢在调节乙醇消费中的重要性。

为了研究潜在机制，研究人员在乙醇配对喂养的Khk^fl/fl和Khk^fl/fl × Alb1-cre小鼠中评估了乙醇代谢。两组小鼠在14个月内消耗了等量的乙醇（约75克/小鼠），且来自乙醇和饲料的热量摄入相匹配。随后对乙醇代谢关键酶的评估显示，两种基因型小鼠的肝脏酒精 dehydrogenase (ADH) 和细胞色素P450 2E1 (CYP2E1) 的表达同样被诱导，表明乙醇向乙醛的转化过程相似。然而，在肠道中，无论是否暴露于乙醇，KHK-A/C敲除小鼠的CYP2E1表达均显著高于野生型对照组。

进一步分析显示，乙醇处理的Khk^fl/fl小鼠表现出 aldehyde dehydrogenase (ALDH) 异构体（ALDH1A1和ALDH2）的强劲上调，促进了乙醛的解毒。相比之下，这些酶的表达在乙醇暴露的Khk^fl/fl × Alb1-cre小鼠中显著降低，表明在缺乏肝脏KHK-A/C的情况下乙醛清除能力受损。此外，负责将乙酸转化为乙酰辅酶A的乙酰辅酶A合成酶1（AceCS1）在野生型小鼠中轻微升高，而在Khk^fl/fl × Alb1-cre小鼠中保持不变。

为了评估乙醇代谢受损的功能性后果，研究人员测量了急性腹腔注射乙醇（3g kg^-1）后的循环乙醇和乙醛水平。在未接触过乙醇的小鼠中，基因型间未观察到显著差异。然而，在乙醇处理过的小鼠中，Khk^fl/fl × Alb1-cre小鼠表现出显著更高的血浆乙醇和乙醛水平，这与慢性乙醇暴露后代谢耐受性降低一致。此外，伏隔核中ΔFosB及其下游靶点（Glur2和Cdk5）的表达——中脑皮质边缘奖赏通路激活的关键标志——在乙醇暴露的Khk^fl/fl × Alb1-cre小鼠中缺失。这些发现暗示，在缺乏肝脏KHK-A/C的情况下，对乙醇的中枢奖赏反应减弱。

肠道果糖代谢在调节乙醇偏好和摄入中的作用

与在肝脏中的作用类似，乙醇以剂量依赖的方式上调空肠中AR和KHK-A/C的表达。正如预期的那样，乙醇暴露增加了空肠中山梨醇和果糖的水平。与在肝脏特异性敲除小鼠（Khk^fl/fl × Alb1-cre）中观察到的表型一致，肠道特异性删除KHK-A/C（Khk^fl/fl × Vil1-cre）也导致乙醇摄入量和偏好的显著降低。这些发现表明，肝脏和肠道中的内源性果糖代谢在小鼠调节乙醇消费和偏好中都具有作用。

为了探索这种肠道效应的潜在机制，研究人员调查了肠-脑激素轴的作用。越来越多的证据支持肠道来源的胰高血糖素样肽-1（GLP-1）在临床前和临床研究中减少酒精摄入的作用。使用小鼠L细胞系GLUTag和离体肠道制备物，研究人员发现乙醇显著抑制了基础GLP-1分泌。值得注意的是，这种抑制可以通过与KHK抑制剂CRP427共同处理来防止，表明KHK活性介导了乙醇诱导的GLP-1释放抑制。此外，KHK抑制后观察到的GLP-1分泌增加与二肽基肽酶-4（DPP-4）活性无关。

重要的是，这些体外研究中使用的乙醇浓度（100μM至25 mM）落在人类饮酒后血浆中观察到的生理范围内，强调了其潜在的临床相关性。与这些发现一致，急性乙醇给药（3g kg^-1，腹腔注射）显著降低了未接触过乙醇和乙醇处理的野生型小鼠的循环GLP-1水平。这种效应在肠道特异性和全身性KHK-A/C敲除小鼠中均明显减弱。这些数据共同表明，乙醇通过肠道中的KHK依赖性机制抑制GLP-1分泌，而抑制肠道KHK可恢复GLP-1信号传导。这种恢复可能有助于在KHK-A/C缺陷模型中观察到的乙醇摄入减少。

阻断肝脏KHK对乙醇代谢和ALD的影响

除了其调节肝脏ALDH表达的既定作用外，果糖还被研究团队及其他研究人员证明具有强大的促脂肪生成和促炎特性。为了研究肝脏果糖代谢在ALD中的贡献，研究人员检查了肝脏特异性删除KHK-A/C的小鼠在慢性乙醇暴露下的影响。

鉴于ALD的特征是肝脏脂肪变性和炎症，研究人员在体积匹配的组别（Khk^fl/fl × Alb1-cre小鼠给予10%乙醇，Khk^fl/fl小鼠给予7.2%乙醇）中，经过14个月的单瓶口服乙醇暴露后评估了肝损伤和功能。值得注意的是，在乙醇消耗、配对喂养的Khk^fl/fl × Alb1-cre和Khk^fl/fl小鼠之间未观察到体重增加的显著差异。此外，肠道通透性评估显示基因型间没有实质性差异，表明肠道屏障功能以及因此的肠道-肝脏轴贡献在两组间相似。

结果显示，Khk^fl/fl小鼠出现了明显的脂肪变性，肝2区和3区主要以大泡性脂质积累为主，并伴有1区和2区的炎症灶、门管区炎症和脂性肉芽肿的存在。这些组织学异常伴随着显著的生化变化，包括肝甘油三酯含量升高、促炎细胞因子（Il6）和趋化因子（Ccl2）表达增加以及关键脂肪生成酶如FAS、ACC和ATP citrate lyase的上调。Khk^fl/fl小鼠的肝损伤通过转氨酶水平升高和纤维化标志物（包括肝羟脯氨酸增加和增强的天狼星红染色（PSR）得到进一步证实。相比之下，这些病理变化在乙醇处理的Khk^fl/fl × Alb1-cre小鼠中大多不存在，表明肝脏KHK-A/C活性是乙醇诱导肝损伤所必需的。

最近在人类和啮齿类动物中的研究已确定FGF21是一种主要由肝脏和脂肪组织分泌的激素，它是果糖摄入的负调节因子，并能防止肝病。对摄入的调节是通过β-Klotho-FGFR1c受体复合物在与奖赏和代谢相关的脑区（如下丘脑和伏隔核）中介导的。为了探索FGF21在乙醇消费和ALD中的作用，研究人员分析了FGF21在果糖代谢遗传模型中的水平。在自愿性双瓶选择条件下，野生型和Khk^fl/fl小鼠的FGF21水平显著高于全身性KHK-A/C敲除、Khk^fl/fl × Alb1-cre和Khk^fl/fl × Vil1-cre小鼠。然而，当乙醇摄入量配对时（即没有自由访问），Khk^fl/fl × Vil1-cre小鼠对乙醇的反应表现出FGF21水平增加。一致地，当Khk^fl/fl × Vil1-cre小鼠被强制长期消耗乙醇时，它们出现了与Khk^fl/fl小鼠相似的ALD特征，提示可能与应激存在交互效应。

这些发现表明，肝脏特异性KHK删除不仅防止乙醇诱导的脂肪变性和炎症，而且还阻止了肝脏和循环FGF21的上调。这与先前在喂食果糖的KHK-A/C敲除小鼠中的观察结果一致，在全身性和肝细胞特异性而非肠道特异性KHK缺陷模型中，FGF21诱导缺失。这些数据共同表明，对乙醇（和观察到的果糖）的FGF21反应不是由底物本身的存在驱动，而是由由此产生的肝损伤驱动。因此，在缺乏肝损伤的Khk^fl/fl × Alb1-cre小鼠中，FGF21没有被诱导。支持这一点的是，发现FGF21水平与血浆AST和肝甘油三酯含量呈正相关，进一步强化了肝损伤与FGF21激活之间的联系。

靶向删除KHK-A/C可逆转小鼠的乙醇偏好和摄入

上述部分的实验旨在确定阻断KHK是否可以阻止小鼠消耗乙醇。为了测试靶向KHK的干预方法是否有利于减少已 preconditioned 偏好乙醇的小鼠的乙醇消费，研究人员进行了一项后续研究，在偏好乙醇的小鼠中诱导删除KHK表达。为此，研究人员使用了在他莫昔芬诱导性Cre重组酶表达的Khk^fl/fl小鼠（受泛素启动子控制，Khk^fl/fl × Ubc-cre）。在他莫昔芬处理10-14天后，Khk^fl/fl × Ubc-cre小鼠的肝脏KHK表达被消除。对照Khk^fl/fl和他莫昔芬诱导性Khk^fl/fl × Ubc-cre小鼠在他莫昔芬处理前的乙醇摄入量和偏好没有差异。然而，在诱导KHK删除后，Khk^fl/fl × Ubc-cre小鼠对乙醇的偏好及其累积乙醇摄入量以时间依赖的方式显著减少。KHK的删除伴随着ALDH1A1和ALDH2表达的显著下调，以及急性腹腔注射后乙醇代谢的减少。

KHK-A/C的药理抑制减少WT、cHAP小鼠和大鼠的自愿性偏好和乙醇摄入

为了确定药理学抑制KHK是否也与减少乙醇消费相关，研究人员测试了KHK的药理阻断在一个高乙醇饮酒小鼠模型中的作用，使用的是交叉高酒精偏好（cHAP）小鼠。KHK的药理抑制是通过使用研究团队开发的化合物CRP427实现的。CRP427能有效抑制KHK-C（在30-40 nM范围内），具有口服生物利用度并被肝脏摄取。在果糖挑战（1.5g kg^-1后，接受CRP427的野生型小鼠血清果糖水平显著增加，但血浆果糖比全身性KHK-A/C敲除小鼠观察到的低40%。这些结果表明CRP427在体内抑制果糖代谢。

cHAP小鼠模型的特点是可自由选择饮酒，并且具有中到高的血液乙醇浓度，类似于AUD患者的情况。研究人员测试了这些偏好乙醇的小鼠，它们的乙醇偏好率高达90%或更高，摄入量接近30 g kg^-1 day^-1，与先前的报告一致。小鼠用CRP427或载体（水）处理5天。结果显示，与载体处理的cHAP小鼠相比，CRP427导致乙醇偏好和总体乙醇摄入量的减少。值得注意的是，当CRP427给予先前已 conditioned 乙醇的野生型小鼠时，也观察到了类似的结果。

此外，偏好乙醇的大鼠在口服操作自我给药模型中表现出自愿性乙醇给药的显著减少，表明开胃性强化减弱。这些数据共同表明，KHK的遗传和药理学靶向可能在减少过度乙醇摄入模型中的乙醇摄入和偏好方面具有潜在相关性。

研究结论与意义

这项研究提供了令人信服的证据，表明ALD以及酒精摄入和偏好至少部分依赖于果糖代谢。酒精和糖的摄入及其代谢似乎通过增加门静脉渗透压而交织在一起，这为治疗AUD提供了新方法。

该研究的主要意义在于：首先，它揭示了乙醇通过激活多元醇通路产生内源性果糖，并通过KHK-A/C代谢，是驱动酒精偏好和肝损伤的共同机制。其次，研究证实了组织特异性效应的存在：肝脏KHK-A/C的缺失通过影响ALDH表达和乙醛清除，改变了乙醇的代谢和奖赏效应；而肠道KHK-A/C的缺失则通过恢复GLP-1的分泌来抑制酒精摄入。第三，药理学抑制KHK同样能有效减少酒精摄入，这为将KHK抑制剂（目前正在为MASLD开发）重新用于治疗AUD和ALD提供了强有力的理论依据。最后，该研究强调了FGF21作为肝损伤标志物而非酒精摄入直接调节因子的角色，并揭示了内源性果糖代谢在酒精相关行为和组织损伤中的核心作用。

这些发现不仅深化了我们对酒精成瘾和肝病机制的理解，而且开辟了新的治疗途径，表明靶向果糖代谢可能同时缓解AUD和ALD，具有重要的临床转化潜力。