本研究探讨了从曲霉属真菌*Aspergillus saitoi*中提取的蛋白酶类型XIII（P13ase）在自下而上的蛋白质组学分析中的应用潜力。传统上，胰蛋白酶（trypsin）被认为是自下而上蛋白质组学的黄金标准，其切割特异性高、消化效率强且易于获取。然而，胰蛋白酶的切割偏好主要针对赖氨酸（Lys）和精氨酸（Arg）的C端，这限制了其对某些蛋白质序列的全面覆盖能力。此外，胰蛋白酶的最适pH值为弱碱性（pH 7-9），这可能导致一些非特异性修饰产物的生成，如脱氨（deamidation）和环化（cyclization）反应产生的副产物，从而影响蛋白质的准确识别和定量分析。
P13ase作为一种酸性非特异性蛋白酶，其最适pH值较低（pH 2.5-3.0），这使得它在酸性条件下能够更有效地进行蛋白质消化。研究者认为，这种特性可能有助于减少因胰蛋白酶在碱性条件下引起的修饰副产物。为了验证这一假设，研究团队在多种pH值、温度和消化时间条件下对P13ase的切割效率和选择性进行了系统评估，并将结果与胰蛋白酶进行了比较。结果显示，在pH 3.5、37°C和60分钟的条件下，P13ase的消化效果最佳，能够实现超过90%的蛋白质序列覆盖，这是胰蛋白酶难以达到的水平。此外，P13ase消化显著减少了脱氨产物和环化反应产物的形成，表明其在减少修饰副产物方面具有优势。
在研究过程中，团队使用了HeLa细胞裂解物作为模型系统，通过纳米液相色谱-串联质谱（NanoLC/MS/MS）技术对消化后的肽段进行了鉴定和定量分析。研究发现，P13ase对赖氨酸、精氨酸和亮氨酸（Leu）的C端具有较高的切割偏好，分别占19%、15%和21%。相比之下，胰蛋白酶对亮氨酸的切割能力较弱，导致其在识别某些蛋白质的序列时存在局限。P13ase不仅能够切割赖氨酸和精氨酸的C端，还能切割亮氨酸的C端，从而提高了对K/R（赖氨酸/精氨酸）贫乏区域的覆盖能力。这一特性使得P13ase在识别复杂蛋白质序列方面更具优势。
研究还分析了P13ase在不同pH值下的消化效率。结果表明，随着pH值的升高，P13ase能够识别的肽段数量增加，但在pH 3.5时达到最佳效果。这一pH值既保持了P13ase的活性，又避免了胰蛋白酶在碱性条件下可能引发的修饰副产物。此外，研究团队发现，在较低pH值下，P13ase的消化时间较短，但肽段的长度分布更广，这可能与消化不完全有关。因此，选择pH 3.5作为P13ase的最适条件，可以平衡肽段的长度分布和消化效率，同时减少修饰副产物的生成。
在温度和时间对P13ase消化效果的影响方面，研究发现较高的温度能够显著缩短达到最大肽段识别数所需的时间，而较长的消化时间则可能导致非特异性切割的增加。尽管在某些情况下，延长消化时间可能会提高肽段的识别率，但同时也可能引入更多的非特异性切割产物，从而影响蛋白质的准确鉴定。因此，研究团队选择了37°C和60分钟作为P13ase的最优消化条件，这一组合能够在保证消化效率的同时，避免过度切割带来的干扰。
为了进一步验证P13ase在减少修饰副产物方面的优势，研究团队对脱氨和环化产物进行了详细分析。结果表明，在P13ase消化条件下，脱氨产物的数量显著低于胰蛋白酶消化。特别是在低pH环境下，P13ase能够有效抑制脱氨和环化反应的发生，从而减少这些非特异性修饰产物的生成。此外，P13ase还减少了N端环化产物的形成，而胰蛋白酶在这一方面表现较弱。这些发现表明，P13ase在酸性条件下的消化过程能够有效降低修饰副产物的干扰，为精准蛋白质组学研究提供了新的工具。
除了减少修饰副产物，P13ase在蛋白质识别的全面性和重复性方面也表现出色。研究团队对P13ase和胰蛋白酶在相同条件下的蛋白质识别结果进行了比较，发现P13ase能够识别的蛋白质数量与胰蛋白酶相近，但在某些蛋白质中，其识别的肽段数量更多，尤其是在序列覆盖度较高的情况下。例如，在对组蛋白H2A（Uniprot accession P0C0S8）的消化中，P13ase实现了95%的序列覆盖，而胰蛋白酶仅达到46%。这表明，P13ase在识别复杂蛋白质结构方面具有更高的效率和准确性。
此外，研究团队还探讨了P13ase在减少二硫键重排（disulfide bond scrambling）方面的潜力。在酸性条件下，二硫键的重排反应被抑制，这使得P13ase在无需使用烷基化试剂（如IAA）的情况下，仍能有效分析蛋白质的天然状态。这一特性对于研究蛋白质的天然修饰状态具有重要意义，尤其是在不需要人工干预的实验设计中。
研究还发现，P13ase的切割偏好不仅限于P1位点，还涉及P2和P3位点。通过冰图（iceLogo）分析，研究团队发现P13ase在P2和P3位点对异亮氨酸（Ile）、缬氨酸（Val）和谷氨酸（Glu）的偏好显著增加。这一发现进一步表明，P13ase的切割模式比胰蛋白酶更为多样化，能够生成更多种类的肽段，从而提高蛋白质组学分析的全面性。
尽管P13ase在某些方面表现优于胰蛋白酶，但其在识别效率方面仍有提升空间。研究团队指出，通过使用数据非依赖采集（DDA）模式和优化开放搜索方法，P13ase的识别和定量性能有望进一步提高。未来的研究可能会集中在这些方向，以充分发挥P13ase在蛋白质组学中的潜力。
总体而言，P13ase作为一种新型蛋白酶，在自下而上的蛋白质组学中展现出显著的优势。其酸性最适pH值能够有效减少脱氨和环化反应产生的修饰副产物，而其独特的切割偏好则有助于提高蛋白质序列的覆盖度。此外，P13ase在较低温度和较短时间内即可完成高效的蛋白质消化，这为快速、高通量的蛋白质组学分析提供了新的可能性。研究结果不仅扩展了P13ase在标准蛋白质组学工作流程中的应用范围，还表明其在需要减少修饰副产物的精准蛋白质组学研究中具有重要价值。未来，随着对P13ase切割特性和优化条件的进一步研究，它有望成为胰蛋白酶的有力补充或替代，为蛋白质组学研究带来新的机遇。
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