在肿瘤的世界里，癌细胞如同狡黠的 “生存大师”。肿瘤微环境中，活性氧（ROS）大量堆积，就像布满危险的 “雷区”。不过，癌细胞进化出强大的抗氧化能力来应对这一危机。谷胱甘肽（GSH）作为细胞内重要的抗氧化剂，其合成的关键酶谷氨酸 - 半胱氨酸连接酶催化亚基（GCLC）起着至关重要的作用。然而，一直以来，GCLC 的活性是否受蛋白质翻译后修饰（PTMs），比如琥珀酰化修饰的调控，却如同迷雾一般，亟待科学家们去揭开。
为了驱散这片迷雾，中国国家生物信息中心、中国科学院北京基因组研究所以及中国科学院大学的研究人员踏上了探索之旅。他们的研究成果发表在《Cell Death & Differentiation》杂志上，为我们揭示了癌细胞在氧化应激下的生存奥秘，也为癌症治疗带来了新的曙光。
研究人员在这项研究中运用了多种关键技术方法。在细胞实验方面，通过慢病毒介导的 shRNA 干扰技术，沉默相关基因的表达，探究基因功能；利用共免疫沉淀（Co - IP）技术，验证蛋白质之间的相互作用；采用 GST pull - down 实验，进一步确认蛋白质间的直接相互作用。在动物实验方面，使用 8 周龄雄性 C57BL/6 小鼠，通过腹腔注射叔丁基过氧化氢（TBH）构建氧化应激模型，研究体内相关分子机制的变化。
下面来看看具体的研究结果。
- GCLC 发生琥珀酰化修饰：研究人员通过将 Flag 标记的 GCLC 转染到 HEK293T 细胞中，再进行 Co - IP 实验，发现 GCLC 存在乙酰化和琥珀酰化修饰。体外实验中，用不同浓度的琥珀酰辅酶 A（succinyl - CoA）处理纯化的 Flag - GCLC 或重组 GST - GCLC 蛋白，结果显示 GCLC 的琥珀酰化水平随 succinyl - CoA 浓度增加而增强。在细胞实验中，用不同浓度的琥珀酸钠处理过表达 Flag - GCLC 的 HEK293T 细胞，GCLC 琥珀酰化水平呈浓度依赖性增强；而用 Fasnall 处理使 succinyl - CoA 耗尽后，GCLC 琥珀酰化水平明显降低。这表明 succinyl - CoA 的浓度会直接影响 GCLC 的琥珀酰化水平。
- GCLC 琥珀酰化导致酶活性降低：研究人员将 GCLC 的 40 个赖氨酸位点逐一突变为精氨酸（R），发现 K38、K126 和 K326 位点突变显著降低 GCLC 琥珀酰化水平，同时突变这三个位点几乎检测不到琥珀酰化修饰。将这三个位点突变为谷氨酸（E）模拟带负电荷的琥珀酰化修饰，同样几乎检测不到琥珀酰化。在 U2OS 细胞中过表达野生型（WT）GCLC 或去琥珀酰化模拟突变体（如 K38R、K126R 等），细胞内 GSH 水平显著提高；而过表达琥珀酰化模拟突变体（如 K38E、K126E 等），细胞内 GSH 水平仅轻微增加，过表达 3KE 突变体的细胞 GSH 水平与空载体对照相似。在检测 GSH 合成速率实验中也得到了类似结果，说明琥珀酰化模拟的 K - E 突变几乎使 GCLC 酶活性丧失。
- 氧化应激通过 GCLC 去琥珀酰化刺激 GSH 合成：用 TBH 处理人肾癌细胞（RCC）ACHN 细胞，发现细胞内 GSH 水平在处理 3 小时后下降，随后迅速上升；用不同浓度 TBH 处理 24 小时，在一定浓度范围内 GSH 水平呈剂量依赖性增加，高浓度时因细胞死亡增多而下降。抑制 GCLC 功能后，TBH 诱导的 GSH 合成受到抑制，说明氧化应激下 GSH 合成依赖 GCLC。用 TBH 或 H2O2处理稳定过表达 Flag - GCLC 的 U2OS 细胞，GCLC 琥珀酰化水平显著下降，且呈剂量和时间依赖性。在体内实验中，给小鼠腹腔注射 TBH，肝脏组织中 GCLC 琥珀酰化水平降低，GSH 水平先下降后上升，表明氧化损伤在体内也能诱导 GCLC 去琥珀酰化并促进 GSH 合成。
- SIRT2 是 GCLC 的去琥珀酰化酶：用 HDAC 抑制剂处理过表达 Flag - GCLC 的 HEK293T 细胞，发现 III 类 HDAC 抑制剂烟酰胺（NAM）可使 GCLC 琥珀酰化水平显著增加，而 I 类和 II 类 HDAC 抑制剂伏立诺他（Vorinostat，SAHA）无此作用，说明 GCLC 去琥珀酰化受 III 类 HDACs 调控。在 HEK293T 细胞中分别共表达 III 类 HDACs 家族成员（SIRT1 - 7）与 Flag - GCLC，只有过表达 SIRT2 能显著降低 GCLC 琥珀酰化水平。沉默 U2OS 细胞中的 SIRT2 或用抑制剂 SirReal2 处理，GCLC 琥珀酰化水平显著增强。体外去琥珀酰化实验也证实，纯化的 HA - SIRT2 蛋白在 NAD+存在下能有效使 GCLC 去琥珀酰化，而失活的 HA - SIRT2 蛋白则无此活性，表明 SIRT2 是 GCLC 的去琥珀酰化酶。
- SIRT2 与 GCLC 直接相互作用：通过 Co - IP 实验，在 Flag - GCLC 的免疫沉淀复合物中检测到内源性 SIRT2，在 Flag - SIRT2 的免疫沉淀复合物中也检测到内源性 GCLC；用抗 GCLC 抗体进行免疫沉淀，发现内源性 SIRT2 与 GCLC 共沉淀。体外 GST pull - down 实验进一步证实了 SIRT2 与 GCLC 的直接相互作用。截短实验表明，GCLC 仅与 SIRT2 的催化核心结构域相互作用，而非 N 端和 C 端。
- SIRT2 调节依赖 GCLC 的 GSH 合成：研究人员检测了一系列人 RCC 细胞系中 SIRT2 表达和 GSH 水平，发现二者呈正相关。在 SIRT2 高表达的细胞系（如 CAKI - 1 和 A498）中敲低 SIRT2，细胞内 GSH 水平和合成速率显著降低，脂质过氧化水平升高；在 SIRT2 低表达的细胞系（如 786 - O 和 ACHN）中过表达 SIRT2，GSH 水平和合成速率显著提高，ROS 和脂质过氧化水平降低。在 GCLC 敲低的 CAKI - 1 和 786 - O 细胞中，改变 SIRT2 表达对 GSH 水平影响不大，说明 SIRT2 调节的 GSH 合成依赖 GCLC。
- 氧化应激激活依赖 SIRT2 的 GCLC 活性：用 TBH 处理细胞后，Flag - SIRT2 免疫沉淀复合物中的内源性 GCLC 水平显著增加，且呈剂量和时间依赖性，说明氧化应激促进 SIRT2 与 GCLC 的相互作用。抑制 SIRT2 活性后，即使没有 TBH 处理，GCLC 琥珀酰化水平也显著升高，且 TBH 诱导的 GCLC 琥珀酰化水平下降被逆转；而过表达 SIRT2 则降低 GCLC 琥珀酰化水平，与 TBH 联合处理时效果更明显。在 ACHN 细胞中，抑制 SIRT2 后用 TBH 处理，GSH 水平诱导增加幅度显著降低；过表达 SIRT2 则使细胞在氧化应激后 GSH 水平迅速增加，表明 SIRT2 参与氧化应激诱导的 GSH 合成调节。
- 组蛋白乙酰转移酶 P300 与 GCLC 相互作用并使其琥珀酰化：通过串联亲和纯化结合质谱分析，发现组蛋白乙酰转移酶 P300 是 GCLC 的相互作用蛋白。Co - IP 实验证实了二者的相互作用，过表达 P300 可增加 WT GCLC 的琥珀酰化水平，而非 3KR 突变体的琥珀酰化水平；用 P300 抑制剂处理可降低 GCLC 琥珀酰化水平，说明 P300 是 GCLC 的主要琥珀酰转移酶。ROS 处理后，GCLC 与 P300 的相互作用显著降低，而与 SIRT2 的相互作用增强。
- GCLC 去琥珀酰化保护癌细胞免受铁死亡：用铁死亡抑制剂 Fer - 1 处理 SIRT2 敲低的 CAKI - 1 细胞，可有效保护细胞免受 TBH 诱导的死亡，而其他细胞死亡抑制剂则无效，表明 SIRT2 - GCLC - GSH 轴在调节癌细胞对铁死亡的敏感性中起关键作用。在 ACHN 细胞中抑制 GCLC 活性或敲低 GCLC，可增强 TBH 诱导的铁死亡，重新表达 WT GCLC 可消除这种增强作用，而 3KE 突变体则不能。敲低 SIRT2 可促进 CAKI - 1 细胞的 TBH 诱导铁死亡，过表达 WT GCLC 可挽救这种铁死亡，而 3KE 突变体则不能，说明癌细胞可通过激活 SIRT2 - GCLC - GSH 信号轴避免氧化应激诱导的铁死亡。
在讨论部分，研究人员指出，肿瘤微环境中高 ROS 水平是癌细胞面临的一大挑战，GSH 的合成对于清除 ROS 至关重要。虽然 GSH 生物合成受多种因素调控，但氧化应激可通过 PTM 快速激活 GCL 活性。本研究发现的 GCLC 琥珀酰化修饰及其调控机制，为理解癌细胞在氧化应激下的生存策略提供了新视角。此外，SIRT2 作为 GCLC 的去琥珀酰化酶，其在调节氧化还原平衡中的作用此前未被报道，丰富了对 SIRT2 功能的认识。同时，明确 P300 作为 GCLC 的琥珀酰转移酶，以及二者相互作用受 ROS 调控，有助于深入了解 GCLC 琥珀酰化的动态调节过程。在癌症治疗方面，干扰细胞抗氧化轴已被尝试用于治疗耐药性实体瘤，但现有抑制剂存在缺乏肿瘤细胞选择性等问题。本研究发现 GCLC 去琥珀酰化介导的快速激活机制，为癌症治疗提供了一个有前景的辅助治疗靶点，有望通过设计针对 SIRT2 - GCLC 相互作用的抑制剂，提高肿瘤治疗效果，同时降低对正常细胞的毒性，改善癌症患者的预后。
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