单细胞及组织原位RNA-蛋白互作与转录组共分析技术MAPIT-seq的开发与应用

本研究针对RNA结合蛋白(RBP)调控机制研究的瓶颈问题，开发了MAPIT-seq技术，通过抗体导向的RNA编辑策略，首次实现了单细胞和组织原位中RBP-RNA互作与转录组的同步分析。该技术成功解析了PRC2复合体弱RNA结合特性，揭示了G3BP1在脑发育中的阶段特异性调控规律，为动态生物学过程及临床样本的转录后调控研究提供了全新工具。

RNA结合蛋白(RBP)作为基因表达调控的关键执行者，控制着RNA的剪接、定位、翻译和降解等生命过程。尽管科学家们已鉴定出超过1,500种人类RBP，但如何在单细胞水平和复杂组织中精确捕捉这些蛋白与RNA的动态互作，始终是领域内的重大挑战。传统技术如CLIP和RIP需要大量样本且无法保留空间信息，而新兴的TRIBE和STAMP等方法又依赖基因改造，限制了在临床样本中的应用。这些技术缺陷严重阻碍了对RBP在发育、疾病中调控机制的深入理解。

为突破这些限制，北京大学的研究团队开发了名为MAPIT-seq（modification added to RBP interacting transcript-sequencing）的革命性技术。这项发表于《Nature Methods》的研究，通过创新的抗体导向编辑策略，首次实现了在单细胞和组织原位同步分析RBP-RNA互作与全转录组，为解析转录后调控网络提供了强大工具。

研究团队采用的核心技术包括：1）双脱氨酶融合系统（rAPOBEC1-pAG-hADAR2dd）实现高灵敏度RNA标记；2）优化交联方案（0.5%甲醛或DSP固定）保持RNA完整性；3）开发生物信息学流程（FLARE分析编辑簇）精确定位互作位点；4）建立单细胞（scMAPIT-seq）和长读长测序流程解析异构体特异性结合。实验验证使用了HeLa、HEK293T细胞系及小鼠胚胎脑组织样本。

设计与优化MAPIT-seq

通过将蛋白A/G与rAPOBEC1和hADAR2dd(E488Q)脱氨酶融合，创建了能同时产生C-to-U和A-to-G编辑的"分子记录仪"。在YTHDF2-FLAG模型中，编辑信号特异富集于PAR-CLIP峰周围（图1b），而0.5%甲醛固定最佳平衡了互作保存与RNA完整性（图1d）。双脱氨酶设计使目标检出率提升20-30%（Extended Data Fig.2b）。

方法学验证

在G3BP1研究中，MAPIT-seq成功捕获了87%的PAR-CLIP已知靶标（图2b），且与ARTR-seq结果高度一致（Extended Data Fig.2e）。敲除实验证实编辑信号强度与G3BP1表达量正相关（Extended Data Fig.2g），证明其特异性。对PTBP1、RBFOX2等RBPs的分析显示，MAPIT-seq能准确识别CU-rich、UGCAUG等特征结合基序（图2g），分辨率接近eCLIP（Extended Data Fig.3f）。

PRC2-RNA互作重新评估

针对PRC2是否结合RNA的争议，MAPIT-seq发现除XIST外，EED、EZH2和SUZ12几乎不结合其他RNA（图3a）。这与CLAP-seq结果形成鲜明对比，提示PRC2的RNA结合可能被既往技术假阳性高估。

组织应用与发育调控

在小鼠胚胎脑部，G3BP1靶标显著富集于神经元发育通路（图4a）。scMAPIT-seq揭示其在G2/M期结合强度最高（Extended Data Fig.8b），且对CENPA等有丝分裂基因呈现正调控，这种相位特异性调控通过ARE元件介导（图5j）。

技术创新

长读长MAPIT-seq首次实现异构体水平分析，发现G3BP1偏好结合长3'UTR的蛋白编码异构体（图6d-f）。10x Genomics平台使单细胞通量达3,000+细胞/样本（Extended Data Fig.7f），且DSP固定方案信噪比较甲醛提高3倍（Extended Data Fig.7c）。

这项研究建立的MAPIT-seq技术体系，突破了现有方法在分辨率、通量和适用范围上的限制。其创新性体现在：1）首次实现单细胞原位互作与转录组并行分析；2）开发双脱氨酶系统提升检测灵敏度；3）兼容冷冻组织临床样本。发现PRC2弱RNA结合特性为表观遗传调控提供新认知，而G3BP1细胞周期依赖性调控机制的解析，则为癌症等疾病治疗靶点开发指明方向。该技术平台有望成为研究发育、神经退行性疾病等领域转录后调控的有力工具。