基于定向进化的嵌合抗原受体T细胞体内再刺激配体发现策略增强CD19 CAR-T抗白血病疗效

本研究针对CD19 CAR-T细胞治疗中存在的功能减退和持久性不足问题，通过酵母表面展示技术定向进化筛选高亲和力肽模拟物（mimotope），开发出两性分子疫苗（amph-vax）增强策略。该方案可显著促进CAR-T细胞扩增、记忆形成及抗肿瘤功能，为临床CAR-T产品提供普适性增效方案。

在癌症免疫治疗领域，CD19靶向的嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）疗法已成功应用于B细胞急性淋巴细胞白血病（B-ALL）和淋巴瘤的临床治疗。然而30-60%患者会出现复发，其中约半数属于CD19阳性复发，这表明CAR-T细胞在体内的功能维持和持久性仍是重大挑战。临床数据显示，虽然高肿瘤负荷患者初期CAR-T扩增更显著，但长期持久性与初始肿瘤负荷无关，提示肿瘤细胞提供的刺激可能不足以维持CAR-T细胞功能。更棘手的是，传统疫苗策略依赖于MHC分子呈递，而CAR-T细胞的T细胞受体（TCR）具有高度异质性，使得常规疫苗方法难以奏效。

为突破这一瓶颈，研究人员在《Nature Biomedical Engineering》发表创新性研究，开发出通用型两性分子疫苗（amphiphilic vaccine, amph-vax）平台。该策略通过定向进化技术筛选能特异性激活CAR的肽模拟物（mimotope），将其与淋巴结靶向的两性分子（PEG-脂质）偶联，形成可被专业抗原呈递细胞（APC）表面展示的合成疫苗。这种设计巧妙模拟了天然免疫应答过程，使CAR-T细胞能在淋巴结中获得最佳共刺激信号。

关键技术包括：1）酵母表面展示系统筛选FMC63单抗（临床CD19 CAR核心元件）的肽模拟物；2）多轮定向进化进行亲和力成熟；3）结构建模验证mimotope与CAR相互作用；4）建立免疫健全的hCD19⁺ Eμ-Myc B-ALL/淋巴瘤小鼠模型；5）人源化NSG小鼠模型中DC-mVax验证体系。临床数据来源于四项CAR-T试验（NCT01626495等）的回顾性分析。

【Directed evolution-based discovery of ligands】研究团队首先通过酵母表面展示技术筛选出能结合FMC63单抗的10肽（P1: RHCPWNCSLL），发现其依赖分子内二硫键形成环状构象。AlphaFold预测显示该mimotope与FMC63的结合界面部分重叠于天然CD19表位。

【Affinity maturation of the CD19 mimotope】通过构建含1.5×10⁸多样性的二代库，获得亲和力提升的F12变体（RICPWNCKEL），再经三代库优化得到F12-A1，其与FMC63的K_d从初始>1 μM提升至9.9 nM。关键发现是N端添加SAS三肽 linker可显著增强结合。

【Mimotope does not interfere with FMC63 recognition of CD19】结构模拟表明mimotope仅部分占据FMC63结合域，实验证实即使在高浓度下，CAR-T细胞仍保持对CD19⁺白血病细胞的识别能力，这对治疗期间维持抗肿瘤活性至关重要。

【Amph-mimotope vaccination triggers CAR-T expansion in vivo】在免疫健全小鼠模型中，amph-F12-A1疫苗使循环CAR-T细胞数量增加10倍，并促进中央记忆表型（CD44⁺CD62L⁺）形成。特别值得注意的是，疫苗需与STING激动剂CDG联用才能实现APCs的持续表面展示。

【Mimotope-DC vaccine promotes leukaemia clearance by CAR-T】为解决NSG小鼠淋巴缺陷问题，研究人员开发了体外负载amph-mimotope的人源DC疫苗（DC-mVax），可使低剂量CAR-T细胞完全清除30%小鼠的白血病负荷，显著优于未加强组。

这项研究的意义在于建立了普适性CAR配体发现平台，其创新性体现在：1）突破天然抗原限制，为任意CAR设计合成疫苗；2）精准调控配体亲和力（9.9 nM）避免细胞因子风暴（CRS）；3）证实淋巴结靶向递送对CAR-T记忆形成的关键作用。与前期开发的超高亲和力（270 fM）FITC-CAR系统相比，适度亲和力的mimotope疫苗在血液肿瘤模型中展现出更好的安全性。该技术已应用于四种FDA批准CD19 CAR-T产品，为改善临床疗效提供了转化路径。