端粒酶修饰RNA（modRNA hTERT）治疗人类肺纤维化：基于RNA的创新疗法及其抗衰老与抗纤维化机制研究

时间：2025年9月22日

来源：Aging Cell

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本综述系统阐述了利用修饰RNA（modRNA）技术递送人端粒酶逆转录酶（hTERT）治疗肺纤维化（PF）的创新策略。研究证实，modRNA hTERT可剂量依赖性激活端粒酶活性，延长端粒长度，改善肺泡Ⅱ型上皮细胞（ATII）增殖能力并减少DNA损伤。在终末期PF患者来源的肺组织切片（PCLS）模型中，该疗法显著降低衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）活性及纤维化标志物（TGFβ、COL1A1）表达，为RNA疗法治疗纤维化疾病提供重要概念验证。

1 引言

肺纤维化（Pulmonary Fibrosis, PF）是一种以肺间质进行性瘢痕形成为特征的致命性疾病，确诊后中位生存期仅4–6年。当前获批药物（吡非尼酮和尼达尼布）仅能延缓纤维化进展，无法逆转疾病。端粒功能障碍已被确认为PF及其亚型特发性肺纤维化（Idiopathic Pulmonary Fibrosis, IPF）的关键风险因素。在家族性PF患者中，约25%存在端粒维持基因（如TERT、TERC、DKC1等）突变，导致肺泡上皮细胞早衰。端粒缩短通过诱导DNA损伤和细胞衰老，促进促纤维化因子分泌，最终导致细胞外基质重塑。因此，通过重新激活端粒酶（负责端粒合成的酶）表达以补充端粒，成为极具潜力的治疗策略。尽管腺相关病毒（AAV）介导的TERT基因疗法在小鼠模型中显示疗效，但存在长期过表达致瘤风险、中和抗体普遍存在等问题。修饰RNA（modified nucleosides modRNA）技术可通过瞬时表达hTERT实现端粒酶活性快速激活，为PF治疗提供更安全、高效的替代方案。

2 方法

2.1 人类肺组织材料

研究使用无病理报告的非吸烟者捐赠的原代人肺泡Ⅱ型上皮细胞（ATII）及经汉诺威医学院伦理委员会批准的终末期PF患者来源的精准肺切片（Precision-cut Lung Slices, PCLS）。患者 demographics 和诊断信息均详细记录。

2.2 细胞培养与转染

人胚胎肺成纤维细胞（MRC-5）、HEK293及原代ATII细胞分别于特定培养基中培养。采用Lipofectamine RNAiMAX试剂转染modRNA，转染效率通过GFP表达验证。细胞增殖能力通过群体倍增水平（Population Doubling Level, PDL）和BrdU掺入实验评估。

2.3 modRNA与环状RNA合成

线性modRNA构建体包含CleanCap AG 5′帽结构、人α-珠蛋白5′UTR、hTERT ORF、人β-珠蛋白3′UTR及分段poly(A)尾，使用修饰核苷m1Ψ增强稳定性并降低免疫原性。环状RNA hTERT通过自剪接内含子系统构建，经RNase R处理富集环化产物，并通过 divergent PCR 验证环化成功。

2.4 功能验证实验

端粒酶活性通过端粒酶重复扩增协议（Telomerase Repeat Amplification Protocol, TRAP）检测；端粒长度通过定量荧光原位杂交（qFISH）和qPCR测量；细胞衰老通过SA-β-gal染色评估；炎症和纤维化标志物（IL6、IL8、TGFβ、COL1A1）通过ELISA检测；先天免疫反应通过干扰素及相关基因（IFNA、IFNB、RIGI、IFIH1）表达水平评估。

3 结果

3.1 modRNA hTERT在MRC-5细胞中激活端粒酶活性

成功合成大小正确的modRNA hTERT（3708 bp）和modRNA GFP（1034 bp）。在MRC-5细胞中，modRNA hTERT转染后24–48小时呈现剂量依赖性的hTERT表达升高和端粒酶活性激活，最低浓度0.25 μg/mL即可诱导显著活性。

3.2 modRNA hTERT在原代人ATII细胞中有效激活端粒酶

电镜确认ATII细胞特征性板层小体结构，转染未影响细胞形态。modRNA hTERT处理导致hTERT表达和端粒酶活性剂量依赖性增加。高剂量（2 μg/mL）转染仅引起短暂免疫反应（IFNB和RIGI短暂升高），48小时后恢复基线水平。

3.3 modRNA hTERT增强增殖能力并改善细胞健康

单次modRNA hTERT处理未显著延长端粒，但重复处理（第0天和第11天）显著提高PDL，伴随衰老标志物（CDKN2A、CDKN1A、TP53）表达下降。BrdU掺入和免疫荧光（Ki67、pH3升高，γH2AX降低）证实增殖增强和DNA损伤减少。长期重复处理最终导致端粒显著延长。

3.4 自剪接环状RNA hTERT延长端粒酶活性持续时间

环状RNA hTERT在转染48小时后保持稳定表达，而线性RNA表达显著下降。TRAP assay显示环状RNA组48小时端粒酶活性显著高于线性RNA组。96小时后，环状RNA处理导致端粒显著延长，且未引起细胞毒性（Caspase 3/7活性未增加）。

3.5 modRNA hTERT降低IPF患者来源PCLS的衰老和纤维化

在终末期PF患者的PCLS中，modRNA hTERT处理显著降低SA-β-gal阳性面积，减少炎症因子（IL6、IL8）和纤维化介质（TGFβ、pro-COL1A1）分泌。环状RNA hTERT较线性RNA展示更持久的hTERT表达和更显著的端粒延长效应，且96小时后免疫反应指标恢复正常。LDH释放实验证实治疗未引起细胞毒性。

4 讨论

本研究首次证实modRNA hTERT可在原代人ATII细胞和PF患者来源PCLS中瞬时激活端粒酶，促进端粒延长、增强增殖、减轻DNA损伤和细胞衰老。环状RNA设计进一步延长作用持续时间。该策略克服了AAV基因治疗的长期风险，且生产成本较低、易于规模化。值得注意的是，hTERT可能通过非端粒机制（如线粒体功能保护）贡献治疗效益。尽管PF异质性可能导致疗效差异（如非TERT突变患者），但本研究在人类疾病模型中展示了抗纤维化、抗衰老和抗炎症的综合效果。未来需优化递送系统（如吸入式LNP或靶向ATII的抗体偶联纳米颗粒），并在临床前模型中评估长期安全性和免疫原性。