膜受体通过聚集磷脂酰丝氨酸激活LC3相关吞噬作用的新机制

本研究揭示了LC3相关吞噬作用（LAP）的启动机制：发现TLR2、CD16等受体通过胞内碱性斑块结构域聚集磷脂酰丝氨酸（PS），进而招募Rubicon-PI3KC3复合物产生PI3P，最终促进ATG8家族蛋白脂化修饰吞噬体膜。该发现阐明了PS介导的信号转导新范式，对先天免疫、抗癌反应等生理病理过程具有重要理论意义。

在细胞免疫学领域，吞噬作用一直是研究的核心课题之一。专业细胞如巨噬细胞通过吞噬凋亡细胞、微生物等颗粒物质，在维持机体稳态中发挥关键作用。传统观点认为，吞噬作用主要依赖于肌动蛋白重塑形成吞噬杯，随后密封形成吞噬体，并通过与溶酶体融合实现降解。然而，LC3相关吞噬作用（LC3-associated phagocytosis, LAP）作为一种自噬蛋白的非经典功能，其启动机制长期以来困扰着研究人员。

LAP过程中，ATG8家族蛋白（包括LC3和GABARAP蛋白）被脂化到单层膜吞噬体上，这一过程在先天免疫、炎症和抗癌反应中扮演重要角色。虽然已知Toll样受体（TLR）和Fc受体等受体的激活可触发LAP，但这些受体共享的通用信号及其启动LAP的分子机制始终不明确。正是这个科学难题，促使Emilio Boada-Romero等研究人员开展了深入探索。

研究人员通过系统的实验发现，能够激活LAP的受体在其胞内区域含有特殊的碱性氨基酸斑块（basic patch）。这些区域能够通过静电相互作用，将磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine, PS）聚集到吞噬体膜上。随后，聚集的PS会招募含有Rubicon的III类PI3激酶复合物（PI3KC3），启动酶促级联反应，最终导致LAP的发生。

值得注意的是，当研究人员通过抗体锁定、基因沉默或药物抑制等方式干扰PS的富集时，LAP过程被显著抑制，吞噬体成熟延迟。这表明PS富集是LAP启动的必要条件。进一步机制研究发现，Rubicon通过其FYVE样结构域与PS结合，从而被招募到吞噬体膜上，并激活VPS34激酶产生PI3P，驱动下游信号通路。

该研究不仅揭示了LAP的启动机制，还发现类似的PS介导的信号转导可能也存在于LC3相关内吞（LANDO）过程中。这为理解膜受体如何通过脂质介导的信号转导调控细胞功能提供了新视角，对先天免疫、抗癌免疫和神经退行性疾病等领域都具有重要意义。

研究人员为开展这项研究采用了多个关键技术方法：使用永生化骨髓来源巨噬细胞（iBMDMs）进行吞噬体分离和脂质组学分析；通过CRISPR-Cas9技术构建基因敲除细胞系（包括TLR2、Rubicon和ATG5敲除）；利用荧光探针（Venus-Lact-C2和Venus-FVIII-C2）实时监测PS动态；采用玻璃支撑脂质双层和脂质球系统研究蛋白-脂质相互作用；应用随机光学重建显微镜（STORM）进行超分辨率成像；通过流式细胞术分析LC3B滞留和PI3P生成；使用特异性抑制剂（GSK-A1和fendiline）调控PS代谢；并开展酵母杀伤实验评估吞噬功能。

Ligands that engage LAP induce phosphatidylserine enrichment in phagosomes

研究人员发现，能够激活LAP的配体可诱导磷脂酰丝氨酸在吞噬体中的富集。通过脂质组学分析显示，TLR2配体Pam3CSK4包被的微珠（Pam3-beads）处理后的吞噬体中PS显著富集，而对照微珠则无此现象。使用特异性PS荧光探针（Venus-Lact-C2和Venus-FVIII-C2）在活细胞中证实了这一发现。TLR2缺失并不影响细胞整体PS水平，但显著降低了吞噬体中PS的富集。研究人员在TLR2胞内结构域中发现了一个碱性氨基酸斑块（628KRKPKK633），该区域对PS富集至关重要。将该区域突变为酸性氨基酸（TLR2^ACID）或删除TIR结构域（TLR2ΔTIR）均消除了PS富集能力，而TLR2信号通路突变（P631H和P681H）则不影响PS富集。

Membrane receptors cluster phosphatidylserine to activate LC3-associated phagocytosis

研究进一步发现，多种能够诱导LAP的受体（包括CD16和Tim4）的胞内结构域都能够引起PS聚集。通过重组蛋白实验证实，TLR2胞内结构域（TLR2-ID）能够特异性结合PS和心磷脂。在平面玻璃支撑脂质双层实验中，野生型TLR2-ID能够引起PS聚类，而碱性斑块突变体则无此功能。类似的，CD16和Tim4的胞内结构域也通过保守的碱性氨基酸区域介导PS聚类，且这种相互作用依赖于静电作用，在高盐条件下被破坏。

PS enrichment in phagosome membranes is required for LAP

为了验证PS富集对LAP的必要性，研究人员采用了多种方法降低吞噬体膜PS水平：使用离子霉素和抗PS抗体将PS锁定在细胞外叶；沉默PS翻转酶（ATP11A和ATP11C）及其伴侣蛋白CDC50A；沉默PS转运蛋白ORP5和ORP8。所有这些干预都显著降低了吞噬体膜PS富集，并抑制了LC3B向吞噬体的募集，但不影响细胞的吞噬能力。功能实验表明，PS富集的缺陷导致吞噬体酸化延迟和酵母杀伤能力下降，这与Rubicon或ATG5缺失的表型相似。

The Rubicon-PI3KC3 complex is recruited to enriched PS in phagosomes to promote LAP

研究发现，Rubicon对于LAP过程中的VPS34活性和PI3P生成至关重要。在Rubicon缺失细胞中，尽管经典自噬正常，但LAP相关的PI3P生成和LC3B脂化显著受损。免疫共沉淀实验表明，Rubicon与PI3KC3复合物组分（VPS34、VPS15和Beclin 1）结合，并在吞噬体上富集。删除Rubicon的 coiled-coil结构域（CCD）破坏了与PI3KC3复合物的相互作用，但不影响其向吞噬体的募集。

Rubicon binds to PS in the phagosome membrane

研究人员发现，Rubicon向吞噬体的募集依赖于PS富集。在PS水平降低的条件下，Rubicon的募集显著减少。TLR2缺失或TLR2^ACID突变也降低了Rubicon向吞噬体的募集。超分辨率显微镜显示，Rubicon与PS探针在吞噬体膜上高度共定位。体外结合实验表明，重组Rubicon优先结合磷脂酸和PS。竞争实验证明，Rubicon C端片段（RubiconΔ1-644）与乳黏附素（Lactadherin）竞争结合吞噬体上的PS。

Rubicon binds to PS lipospheres coupled with receptor basic patches

通过脂质球实验进一步证实，Rubicon C端片段能够结合含有20%PS且加载了CD16-ID的脂质球，但当CD16-ID的碱性斑块突变后，这种结合被消除。类似的结果也在TLR2-ID和hTIM4-ID中观察到，表明受体胞内域的碱性斑块驱动的PS聚类是Rubicon募集的必要条件。

Binding of Rubicon to PS via its FYVE-like domain is essential for LAP

研究人员发现，Rubicon的FYVE样结构域中的一个碱性氨基酸区域（KRLR）对PS结合至关重要。将该区域突变为酸性氨基酸（Rubicon^{FYVE MUT}）或丙氨酸（Rubicon^{FYVE ALA}）显著降低了Rubicon与脂质的共沉淀，并消除了其向吞噬体的募集能力。尽管这些突变体仍能结合PI3KC3复合物，但不能恢复PI3P生成、LC3B脂化或吞噬体酸化。

研究结论与讨论

本研究系统阐明了LAP的启动机制：激活LAP的受体通过其胞内碱性斑块结构域聚集PS，形成高浓度PS区域；这些区域招募Rubicon-PI3KC3复合物，产生PI3P；PI3P进而招募E3连接酶复合物ATG16L-5-12，催化ATG8家族蛋白在吞噬体膜上的脂化修饰；最终促进吞噬体与溶酶体融合和内容物降解。

该研究的重要意义在于发现了一种新型的PS介导的信号转导机制。与传统认知不同，这种信号转导从PS聚类受体（如TLR2、CD16和TIM4）开始，到下游PS结合蛋白（如Rubicon）结束，代表了一种全新的膜受体信号转导模式。

研究人员还指出，类似的机制可能也存在于LC3相关内吞（LANDO）过程中。他们发现，沉默ORP5/ORP8、ATP11A/ATP11C或CDC50A会延迟TREM2受体的回收，这与ATG5缺失的表型相似。TREM2胞内尾部也存在潜在的碱性斑块，提示LANDO可能采用类似的PS富集和Rubicon招募机制。

值得注意的是，虽然乳黏附素和Rubicon在体外能够竞争结合PS，但在细胞中，一旦足够的Rubicon-VPS34复合物被招募到吞噬体上，PI3P的快速生成可能驱动下游事件，克服这种竞争。

这项研究不仅揭示了LAP和LANDO等重要细胞过程的分子机制，还为理解蛋白质-脂质相互作用在细胞信号转导中的作用提供了新视角。由于LAP和LANDO在先天免疫、抗癌免疫和神经退行性疾病中的重要作用，这一发现可能为相关疾病的治疗提供新的靶点和思路。未来，开发能够特异性调控吞噬体 temporal 脂质组成的新工具，将有助于更深入理解这一动态膜过程。