女性生殖道天然淋巴细胞空间功能多样性揭示抗HIV病毒反应新机制

本刊推荐：为解决女性生殖道(FGT)黏膜免疫中天然淋巴细胞(ILCs)的抗病毒作用机制不明的问题，研究人员通过多组学技术揭示了FGT中ILC亚群的空间分布和功能特性，发现ILC1s和ILC3s在稳态下预载细胞因子并能快速响应HIV刺激，为黏膜免疫保护提供了新见解。

在艾滋病防治领域，女性通过性传播感染HIV（人类免疫缺陷病毒）的风险始终存在，但生殖道黏膜的天然防御机制仍有许多未解之谜。虽然完整的上皮屏障、黏液和天然免疫细胞等保护机制已被认知，但病毒突破防御的初始事件及其与宿主免疫细胞的早期相互作用，由于发生在几分钟内，难以在体内捕捉。这使得开发有效的预防措施面临巨大挑战。尤其是一种名为天然淋巴细胞（ILCs）的组织驻留淋巴细胞，它们缺乏抗原特异性受体，专长于细胞因子分泌，在黏膜免疫中可能扮演关键角色，但它们在女性生殖道中的分布、功能及对HIV的应答机制却几乎未被探索。

为此，Alexandra Werner、Laura Moreno de Lara等研究人员在《Nature Immunology》发表了最新成果，通过整合光谱流式细胞术、CITE-seq（细胞索引转座酶可及性染色质单细胞测序）和ChipCytometry（芯片细胞术）等尖端技术，首次系统解析了人类女性生殖道中ILCs的空间分布、功能特性及其对HIV刺激的快速应答机制。

研究团队主要采用了以下关键技术方法：从接受子宫切除术的患者获取子宫内膜（EM）、宫颈内膜（END）和宫颈外膜（ECT）组织样本，通过酶消化制备混合细胞悬液；利用高维光谱流式细胞术进行细胞表型分析和细胞内细胞因子检测；应用CITE-seq技术对HIV刺激30分钟后的细胞进行单细胞转录组和表面蛋白同步分析；采用ChipCytometry实现多重荧光空间显微成像以确定细胞的空间定位；并通过统计学方法对数据进行分析，包括非参数检验和相关性分析等。

ILCs在女性生殖道黏膜稳态中携带抗病毒细胞因子

研究人员首先通过高维光谱流式细胞术鉴定出CD45⁺、谱系阴性（Lin^-）、CD127⁺的ILCs群体，并排除经典自然杀伤（NK）细胞（CD335^-CD94^-CD127^-）。发现ILCs约占单个核免疫细胞的0.52%，且子宫内膜中的ILCs数量显著高于宫颈外膜。根据CD294（CRTH2）和CD117（c-Kit）表达，将ILCs分为ILC1s（CD294^-CD117^-）、ILC2s（CD294⁺）和ILC3s（CD117⁺），其中ILC1s和ILC3s是主要亚群，且分布呈现区域特异性：ILC1s富集于宫颈内膜和宫颈外膜，而ILC3s富集于子宫内膜。转录因子分析显示ILC1s表达T-bet、ILC2s表达GATA-3、ILC3s表达RORγt，符合经典定义。更重要的是，在未刺激状态下，ILC1s和ILC3s分别组成性产生干扰素γ（IFNγ）和白介素22（IL-22），且生殖道ILCs是这两种细胞因子的主要来源，表明它们可能作为一线防御力量参与黏膜稳态维持和抗病毒准备。

无偏聚类揭示组织驻留标志物和功能亚群分化

通过无监督聚类分析（FlowSOM），研究者将ILCs分为10个簇，并发现子宫内膜ILCs表型最为独特。大多数ILCs高表达组织驻留标志CD69，部分共表达CD103（α_E整合素）。CCR6（CC趋化因子受体6）主要在ILC3s上表达，且富集于子宫内膜。根据CD103和CCR6表达，可将ILC3s分为CCR6^-、CCR6⁺CD103^-和CCR6⁺CD103⁺三个功能亚群，其中CCR6^-亚群富集于宫颈外膜，而CCR6⁺CD103^-富集于子宫内膜。CD161（NK1.1）的表达在子宫内膜和宫颈ILCs间存在显著差异，且与CD103⁺ILC1s和ILC3s共表达，提示其作为区分功能亚群的关键表面标志。

CD161和NKp44区分稳态下的功能ILC亚群

功能研究表明，CD161^-ILC1s的IFNγ产生能力更强，而CD161⁺ILC3s的IL-22分泌更显著。尤为值得注意的是，研究人员发现ILC3s在稳态下即发生脱颗粒（CD107a表达），且这一现象特异性地发生于CCR6⁺CD103^-ILC3s亚群，并主要局限于子宫内膜。NKp44（自然细胞毒性受体）特异性地表达于ILC3s，且富集于子宫内膜，主要存在于CCR6⁺CD103^-亚群中。NKp44⁺ILC3s与CD107a共表达，并在PMA（佛波酯）刺激后显著上调脱颗粒水平，而NKp44^-ILC3s则主要响应PMA分泌IL-22，表明这两个亚群功能分工不同。

NKp44⁺ILC3s定位于子宫内膜淋巴聚集体内

通过ChipCytometry空间成像技术，研究者观察到子宫内膜中存在由CD3⁺T细胞和CD20⁺B细胞组成的淋巴聚集体，其中 exclusively 存在NKp44⁺CCR6⁺ILC3s（包括CD161⁺和CD161^-），它们与T细胞、B细胞紧密互作。而NKp44^-ILC3s则位于子宫内膜腺体附近，与基质细胞相互作用。在宫颈外膜，ILC1s分散分布，靠近复层上皮，其中CD103⁺ILC1s位于上皮基底层附近，而CD161⁺ILC1s分布于组织深层。这种空间定位的差异提示不同ILC亚群可能通过不同的细胞互作方式发挥免疫功能。

年龄和妊娠史调控生殖道ILC亚群分布

研究发现，随着年龄增长，宫颈外膜中ILCs比例下降，而子宫内膜中ILC1s比例增加、ILC3s比例减少，提示年龄相关的免疫重塑具有组织特异性。更有趣的是，末次妊娠后的时间与子宫内膜ILCs比例呈正相关，且既往妊娠者的宫颈外膜ILCs表达更高水平的CD161。这些发现表明，生殖道ILCs的分布和表型受到年龄和生殖历史的动态调节，这可能影响黏膜免疫状态和对病原体的易感性。

ILCs通过转录重编程快速响应HIV刺激

通过CITE-seq分析HIV刺激30分钟后的细胞反应，研究人员在ILC富集簇中鉴定出多个显著上调的基因，包括与细胞增殖相关的PRIM1、趋化因子CXCL8、PKC底物PLEK、促炎细胞因子IL1B和TNF、抗凋亡蛋白BCL2A1、淋巴细胞迁移相关蛋白CD52以及增加活性氧（ROS）的ROMO1。同时，下调基因包括抑制ROS产生的CYGB和RHOBTB3、抑制增殖的UBA7和CNOT3等。基因富集分析显示，HIV刺激后ILCs的应答涉及中性粒细胞趋化、对脂多糖的细胞应答、细胞表面信号传导和ROS产生等多个先天免疫相关通路。

ILCs通过细胞因子分泌和表面受体调节应答HIV

流式分析发现，部分ILCs表达低水平的CD4（富集于宫颈ILC1s）和CCR5，且存在CD4⁺CCR5⁺双阳性群体，提示少数ILC1s可能通过经典HIV受体介导病毒进入。HIV刺激30分钟后，CD161^-ILC1s出现细胞内IFNγ含量降低和脱颗粒增强，并伴随CD4下调和颗粒性降低，而gp120刺激仅引起脱颗粒反应，表明HIV受体 engagement 仅部分介导了这一应答。对于ILC3s，HIV刺激引起CD161⁺亚群IL-22含量下降和NKp44表达上调，但gp120刺激无此效应，说明ILC3s的应答不依赖经典HIV受体。值得注意的是，同一样本中的T细胞和NK细胞在30分钟内未出现类似反应，凸显了ILCs应答的快速性和特异性。

本研究系统揭示了女性生殖道中ILCs的空间分布和功能多样性，以及它们作为快速应答者在抗HIV黏膜免疫中的潜在作用。研究发现ILC1s和ILC3s在稳态下即"预装"抗病毒细胞因子，并能在HIV暴露后数分钟内通过细胞因子释放和表面受体调节作出反应。此外，ILC亚群的分布和功能受到年龄和妊娠史的动态调节，且子宫内膜中独特的NKp44⁺ILC3s群体通过定位于淋巴聚集体和脱颗粒作用，可能参与细胞间免疫调节。这些发现不仅深化了对女性生殖道黏膜免疫机制的理解，也为开发针对HIV等性传播感染的黏膜疫苗和预防策略提供了新思路。未来的研究需要进一步阐明ILCs与HIV相互作用的直接机制，以及这些细胞在体内抗病毒保护中的具体功能。