基于纳米孔测序与深度学习的急性白血病快速表观基因组分类系统MARLIN的开发与验证

时间：2025年9月23日

来源：Nature Genetics

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本研究针对急性白血病传统诊断方法耗时长、无法全面捕捉疾病异质性等问题，开发了基于全基因组DNA甲基化谱的快速分类框架MARLIN。研究人员构建了包含2,540例样本的参考队列，定义了38个甲基化类别，并通过神经网络实现对纳米孔测序数据的实时分析。结果显示，该方法在2小时内即可完成高精度分类（26例中25例吻合），显著优于常规诊断所需数天至数周时间，为急性白血病的精准诊疗提供了突破性技术支撑。

急性白血病是一种侵袭性血液癌症，根据造血细胞谱系可分为急性髓系白血病(AML)、B细胞淋巴母细胞白血病/淋巴瘤(B-ALL)、T细胞淋巴母细胞白血病/淋巴瘤(T-ALL)等类型。当前诊断依赖形态学、流式细胞术、核型分析和靶向测序等多重检测，通常需要数天至数周才能完成，且可能遗漏部分疾病亚型的识别。这导致治疗决策延迟，特别是对于罕见或遗传学特征不明确的病例，传统方法存在明显局限。

近年来，DNA甲基化分析在肿瘤分类中展现出巨大潜力。在中枢神经系统肿瘤领域，基于甲基化谱的分类方法不仅提高了诊断准确性，还发现了新的肿瘤类别。纳米孔测序技术的出现更进一步，能够直接检测DNA甲基化状态，无需亚硫酸氢盐转化等预处理步骤，为实时表观遗传分析提供了可能。然而，将甲基化分类应用于急性白血病仍面临两大挑战：一是需要构建涵盖所有疾病亚型的全面参考队列，二是需开发能够处理纳米孔测序初期极低覆盖度数据的计算方法。

在这项发表于《Nature Genetics》的研究中，研究团队建立了急性白血病DNA甲基化参考队列，包含2,540个高质量样本，来自11个已发表的甲基化阵列数据集。通过t-SNE降维分析，研究人员观察到样本按谱系清晰分离，并在各谱系内部发现显著的表观遗传异质性。最终定义了38个甲基化类别，其中25个与既往研究一致，4个通过细分现有类别产生，9个为首次报道。值得注意的是，甲基化分类与免疫表型分型结果高度一致（97.3%吻合），但对于混合表型急性白血病(MPAL) cases，71.4%被重新分类为单一谱系，表明甲基化特征更能反映分子驱动而非表面标志物。

研究特别聚焦AML的异质性，发现了8个新甲基化类别。遗传驱动定义的类别（如PML::RARA、RUNX1::RUNX1T1等）显示出95.5%的分子改变符合率，而CEBPA突变病例中，位于CEBPA甲基化类别外的13例均伴有其他白血病相关基因突变，且缺乏典型bZIP结构域插入缺失，临床预后显著较差。这印证了转录组研究的类似发现，表明表观遗传特征能够补充遗传学分类的不足。

HOX激活的AML类别尤其引人注目。研究不仅确认了NPM1突变与KMT2A重排的关联，还发现了这些遗传改变分布于多个不同的HOX甲基化类别中。在HOXA/B激活的第4组中，24.7%病例缺乏已知遗传驱动，但95.2%的病例显示强烈的HOXA9和HOXB5表达，提示甲基化分类可能直接检测HOX激活状态，为menin抑制剂治疗提供线索，无论其遗传驱动如何。

基于这一参考队列，团队开发了神经网络分类器MARLIN（甲基化与AI引导的白血病亚型快速推断系统）。该网络使用357,340个高质量甲基化位点作为输入，包含两个隐藏层，输出层对应42个类别（38个白血病类别+4个对照类别）。关键创新是在每个训练周期随机丢弃99%的输入CpG位点，使模型适应稀疏数据。交叉验证显示，MARLIN在谱系、甲基化类别和类别家族水平的F1分数分别达0.99、0.91和0.96。即使在97%稀疏度（相当于10,720个CpG位点）下，性能仍保持稳定。

在纳米孔测序回顾性队列（19例）中，16例高置信度预测样本中的15例（93.8%）与常规病理评估一致。两个融合定义AML病例（AL_010和AL_024）通过高覆盖度PromethION测序证实了RUNX1::RUNX1T1和PML::RARA融合。一例CEBPA突变病例（AL_014）因伴有NPM1和DNMT3A共突变，被正确归类为HOXA/B激活第4组而非CEBPA类别。一例B-ALL病例（AL_002）通过甲基化分类发现了具有预后意义的隐匿性DUX4重排。唯一不一致病例（AL_005）被预测为AML IDH富集类别，而临床诊断为Ph+(p190) B-ALL，后续检查发现7q和16q染色体缺失（髓系肿瘤常见）及髓系抗原CD13/CD33共表达，提示可能为谱系模糊病例。

扩展验证中，15例多重测序样本的10例高置信度预测全部与病理结果吻合。健康供体和骨髓增生异常综合征(MDS)样本分析表明，MARLIN能区分MDS与急性白血病，但也提示了应用限制——不应将分类器用于未达到急性白血病标准诊断的病例。

研究最后验证了实时分类可行性。首例前瞻性病例（RTC_001）在样本接收后56分钟处理加40分钟测序内，即获得AML TP53/非整倍性富集类别的高置信度预测，4天后常规诊断确认AML伴TP53突变。第二例病例（RTC_002）同样在95分钟内获得HOXA/B激活第2组（NPM1/TET2富集）预测，与后续发现的NPM1、TET2和FLT3-ITD突变及单核分化特征一致。其余三例前瞻性病例也分别获得准确分类。

技术方法方面，研究主要采用：1）从公共数据库获取11个甲基化阵列数据集（共2,540样本）构建参考队列；2）使用t-SNE降维和半监督聚类定义甲基化类别；3）开发MARLIN神经网络模型，使用keras框架训练；4）回顾性和前瞻性临床样本纳米孔测序（MinION/PromethION平台）；5）通过modkit工具提取甲基化呼叫并输入MARLIN预测；6）使用Panel测序和细胞遗传学分析验证结果。

研究结果部分显示，综合参考队列成功捕捉了急性白血病的全谱系多样性。甲基化分类与免疫表型高度一致，但对特定遗传驱动病例（如ZNF384重排、PICALM::MLLT10、BCL11B激活等）更反映分子本质而非表面标志物。AML分析揭示了超越遗传学分类的异质性，特别是HOX激活类别与menin抑制剂治疗响应的潜在关联。

MARLIN分类器在交叉验证中表现出色，即使在高稀疏数据下仍保持稳定性能。纳米孔测序回顾性队列验证了其临床实用性，不仅与常规诊断高度一致，还提供了更精细的分子分型。实时分析证明该方法能在2小时内提供初步分类，极大缩短诊断时间。

研究结论表明，DNA甲基化谱为急性白血病分类提供了强大工具，能够补充甚至增强标准诊断检测。通过纳米孔测序与MARLIN结合，能够在极短时间内生成可靠的分子分类，解决传统诊断的盲点，特别是对于隐匿性重排或谱系模糊病例。虽然当前参考队列可能对某些罕见亚型覆盖不足，且不包含治疗后或复发样本，但这一框架为临床急性白血病诊断提供了全新范式，未来可通过扩大样本量和纳入更多疾病实体不断完善。