腺相关病毒（AAV）作为基因治疗的重要载体，已在脊髓性肌萎缩症（SMA）、血友病等遗传病治疗中展现出潜力。然而，静脉注射AAV疗法常引发肝毒性，严重时甚至导致急性肝衰竭，其机制至今未明。传统观点认为免疫反应或载体直接毒性是主因，但制造过程中残留的质粒污染物是否参与肝损伤始终缺乏直接证据。2026年1月发表于《Nature Medicine》的一项研究，通过对一例接受Onasemnogene abeparvovec（OA）治疗后发生严重肝炎的SMA患儿肝组织进行多组学分析，揭开了AAV相关肝毒性背后的复杂基因组层面机制。
为揭示肝毒性成因，研究团队整合了短读长与长读长宏基因组测序、原位杂交及分子实验。他们首先对患儿肝活检组织进行无偏倚测序，发现非人源序列除OA载体外，竟包含AAV2/9包装质粒（pAAV2/9）、载体质粒（pSMN）和辅助质粒（pHelper）的序列，且这些序列以重组形式存在。通过特异性探针原位杂交，在5.1%-5.8%的肝细胞中确认了质粒来源的细菌复制原点（ori）和AAV9衣壳基因信号，显著高于对照组。长读长测序进一步显示，载体基因组存在大量超包装极限（最高达15 kb）的多联体结构，并频繁与质粒序列发生重组。此外，研究还在肝组织中检测到人类β疱疹病毒6B（HHV-6B）全基因组覆盖，但其RNA阴性提示无活跃复制。
关键实验方法概述
研究采用临床残留肝组织样本，通过Illumina短读长和纳米孔长读长测序进行无偏倚病毒检测；利用质粒参考序列比对识别污染物；通过RNAscope原位杂交定位核酸分布；采用特异性PCR验证病毒存在；使用生物信息学工具分析嵌合读段与基因组整合事件。
肝活检显示免疫细胞浸润与肝细胞损伤
组织学分析发现门脉区及小叶内以CD4+/CD8+T细胞为主的炎症浸润，伴肝细胞气球样变（图2a-d）。免疫组化排除腺病毒感染，病理特征与野生型AAV2相关肝炎相似。
质粒污染物与载体基因组重组是肝内DNA复杂结构的核心
宏基因组测序显示，最初被误判为野生型AAV2和腺病毒的序列实际来源于制造质粒（图3a,c）。长读长数据揭示超过80%的载体相关读段形成复杂多联体，且pAAV2/9的rep/cap区与pHelper的腺病毒基因区频繁重组（图5）。这些结构可能由质粒残留序列（如rep基因）在细胞内借助辅助病毒（如HHV-6B）引发载体复制所致。
载体-人类基因组嵌合事件存在但转录活性低
短读长数据发现大量载体-人类基因组连接点，但RNA水平仅少量嵌合转录本，且无整合热点（扩展数据图4），表明多数重组DNA未稳定表达。
研究结论强调，AAV疗法后肝组织中存在的制造质粒污染物可能通过与载体基因组重组形成复杂DNA结构，进而触发免疫反应或直接毒性。HHV-6B等辅助病毒或许放大这一过程。该发现不仅解释了部分肝毒性的分子基础，更对AAV载体生产工艺优化（如杂质清除）和患者管理（如辅助病毒筛查）具有紧迫指导意义。未来需在更大队列中验证这些结构的普遍性及其与肝损伤的因果关系，以推动基因治疗安全性的跨越式提升。
