胰腺癌是最具侵袭性的恶性肿瘤之一，预计到2030年将成为美国癌症相关死亡的第二大原因。其五年生存率仅为13%，治疗面临巨大挑战。胰腺癌肿瘤微环境(TME)具有致密基质和多种细胞成分，其中超过90%为非肿瘤细胞，如癌症相关成纤维细胞(CAFs)、内皮细胞和免疫细胞。这种复杂的微环境导致胰腺癌对放疗、化疗等传统治疗产生耐药。因此，开发针对胰腺癌的新治疗策略迫在眉睫。
肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)是胰腺癌基质中最丰富的免疫细胞，在塑造免疫抑制性TME中起关键作用。尽管胰腺TME包含来自循环单核细胞衍生的巨噬细胞和组织驻留巨噬细胞，但新兴证据表明后者在促进肿瘤生长和转移中发挥重要作用。巨噬细胞具有高度可塑性，可在经典激活的M1表型和替代激活的M2表型之间转换，这两种表型具有不同的分泌和代谢特征以及细胞表面标志物表达。例如，M1极化巨噬细胞主要表现促炎特性、抗肿瘤作用和高表达一氧化氮合酶(NOS2)。相反，M2巨噬细胞与抗炎反应相关，促进肿瘤生长，并显示CD206和精氨酸酶-1(ARG1)表达增加。TAMs主要类似于M2表型，尽管新出现的文献表明它们表现出混合表型。
胰腺癌细胞与周围巨噬细胞之间的一种潜在交叉通讯机制是胰腺癌细胞衍生的细胞外囊泡(EVs)的释放，这些囊泡作为调节巨噬细胞可塑性的导管。EVs是小的膜结合颗粒，包裹着由蛋白质、核酸和代谢物组成的生物活性 cargo。增殖的肿瘤细胞利用EVs与周围细胞主动通讯，调节TME朝向生长、存活和转移。包装进EVs的 cargo多样性有可能对受体细胞诱导一系列效应。多项研究表明，肿瘤衍生的EVs可以被TME中的细胞（包括上皮细胞、成纤维细胞和内皮细胞）内化，导致表型改变。EVs也已知抑制或改变免疫细胞功能，并据报道促进转移前微环境的形成。
研究人员假设胰腺癌衍生的EVs在摄取后重编程巨噬细胞向M2样TAM表型。确实，他们发现胰腺癌EVs被骨髓衍生巨噬细胞(BMDMs)内化使它们偏向M2样TAM表型，其特征是CD206表达增加、抗炎细胞因子分泌升高、鸟氨酸和脯氨酸丰度增加，同时精氨酸水平降低，表明高精氨酸酶1活性。胰腺癌EV处理的巨噬细胞在体外和体内抑制CD8+T细胞增殖。小RNA测序显示胰腺癌EV cargo高度富含miR-182-5p；这是巨噬细胞重编程的关键驱动因子。将外泌体miR-182-5p递送至巨噬细胞导致Toll样受体4(TLR4)表达下调、Janus激酶2(JAK2)、信号转导和转录激活因子3(STAT3)信号通路上调以及IL-10和TGFβ分泌升高。最终，该信号通路的失调结合受体巨噬细胞分泌谱的改变导致巨噬细胞表面ARG1和免疫抑制配体程序性细胞死亡配体1(PD-L1)表达增加，从而赋予免疫抑制性TAM表型。抑制miR-182-5p在体外减轻了TAM表型，并在体内减少了胰腺癌肿瘤病变的数量和大小。
主要技术方法
本研究采用多种关键技术：通过尺寸排阻色谱法(SEC)分离胰腺癌细胞系（包括PANC-1、PPCL-68、mT3-2D）和非肿瘤性胰腺上皮细胞系（hTERT-HPNE）来源的EVs，并通过纳米颗粒跟踪分析(NTA)、冷冻电镜(cryo-EM)和免疫印迹分析进行表征；利用流式细胞术(FC)和共聚焦显微镜分析EVs的摄取情况；通过小RNA/microRNA测序分析EV cargo中的miRNA表达谱；采用多重反应监测质谱(MRM-MS)进行靶向代谢组学分析；通过体外和体内实验（包括免疫缺陷Rag1 KO小鼠和免疫活性C57BL/6小鼠原位胰腺癌模型）评估巨噬细胞极化和T细胞功能；使用抗PD-1和抗PD-L1抗体进行阻断实验；通过qRT-PCR、Western blot和免疫荧光分析基因和蛋白表达。
研究结果
胰腺癌EVs重编程巨噬细胞向M2样肿瘤相关巨噬细胞表型
研究发现，与hTERT-HPNE EVs相比，胰腺癌细胞分泌更多EVs。所有细胞系EVs的平均粒径均低于200nm。免疫印迹分析证实了EV标志物（CD63、EpCAM、ANXA5、TSG101、FLOT1、ICAM、ALIX和CD81）的表达。共聚焦显微镜显示，所有EV类型（非肿瘤性或胰腺癌来源）均被巨噬细胞内化。流式细胞术分析显示，EVs被小鼠和人类巨噬细胞摄取呈时间依赖性，从3h开始，约12h达到峰值，且胰腺癌EVs的摄取效率高于非肿瘤性细胞EVs。体内实验也证实胰腺癌EVs摄取率显著高于非肿瘤EVs。胰腺癌EV处理的BMDMs导致CD206+细胞群显著增加，同时CD86+细胞减少。qRT-PCR分析显示，胰腺癌EV处理的BMDMs中M2标志基因ARG1相对表达量更高，而M1相关标志物CD80和CD86显著下调。细胞因子分析表明，胰腺癌EVs处理的巨噬细胞抗炎细胞因子（TGF-β1、IL-10、MDC、CCL-17、GM-CSF和IL-6）分泌显著增加，同时某些促炎细胞因子（TNF-α、IL-12p40、IL-1β和IL-18）也升高。代谢组学分析显示，胰腺癌EVs处理的BMDMs中精氨酸显著耗竭，同时鸟氨酸和脯氨酸细胞内丰度增加。胰腺癌EVs处理的BMDMs中ARG1表达显著升高。
胰腺癌EVs教育的巨噬细胞在体外和体内发挥免疫抑制功能
研究发现，胰腺癌EVs处理的BMDMs显著抑制CD4+和CD8+T细胞增殖。当使用Transwell将巨噬细胞与CD8+T细胞分开培养时，观察到接触非依赖性抑制，但效率较低。体内实验表明，接受胰腺癌EVs处理巨噬细胞的小鼠血液和脾脏中存活CD8+T细胞数量显著下降，增殖的Ki67+CD8+T细胞数量减少，IFNγ+CD8+T细胞数量也显著降低。
胰腺癌EVs教育的巨噬细胞的免疫抑制功能依赖于PD-L1
流式细胞术、Western blot和免疫荧光分析均证实，胰腺癌EVs处理的BMDMs和THP-1巨噬细胞PD-L1表达显著上调。体内实验也显示，注射胰腺癌EVs的小鼠腹腔巨噬细胞(PCMs)中PD-L1+群体显著增加。使用抗PD-1和抗PD-L1抗体阻断PD-1/PD-L1相互作用可显著挽救CD4+和CD8+T细胞抑制。此外，胰腺癌EVs处理的BMDMs显示IL-10和TGF-β分泌升高，这两种细胞因子已知可正向调节PD-L1表达。使用相应抗体阻断IL-10和TGF-β可显著挽救CD8+T细胞抑制。
胰腺癌EVs中富含的miR-182-5p是诱导M2样TAM表型的关键驱动因子
小RNA测序显示，胰腺癌EVs cargo中miR-182-5p显著富集。靶点预测分析显示TLR4是miR-182-5p的直接靶点。胰腺癌EVs处理的BMDMs中miR-182-5p水平升高，TLR4表达降低。Western blot分析证实胰腺癌EVs处理的BMDMs和THP-1巨噬细胞中TLR4下调。TCGA分析显示PDAC肿瘤组织中TLR4表达低于健康胰腺组织。转染miR-182-5p mimic的巨噬细胞显示miR-182-5p表达升高，TLR4 mRNA表达降低，ARG1和PD-L1表达上调。相反，转染miR-182-5p inhibitor导致miR-182-5p表达降低，TLR4表达恢复，ARG1和PD-L1表达下调。流式细胞术分析显示，miR-182-5p mimic转染的BMDMs中CD206和PD-L1表达升高，而inhibitor转染的BMDMs中这些标志物表达降低。在BMDMs中抑制miR-182-5p可增加TLR4表达，降低ARG1和PD-L1表达，且后续PPCL-68 EVs处理无法逆转此效应。
抑制胰腺癌细胞中的miR182-5p损害胰腺癌EVs极化巨噬细胞向M2样TAM表型的能力
用miR-182-5p inhibitor处理PPCL-68细胞后，其来源的EVs中miR-182-5p payload降低。用这些低miR-182-5p payload的EVs处理THP-1巨噬细胞，导致ARG1和PD-L1表达降低，表明巨噬细胞向M2样TAM表型重编程的能力受损。
抑制miR-182-5p在免疫活性小鼠中减少肿瘤生长
在免疫活性小鼠原位胰腺癌模型中，治疗性递送antagomiR-182-5p导致肿瘤大小、体积和重量显著减少，生存期延长。组织病理学分析显示，inhibitor治疗组肿瘤组织正常区域增加。肿瘤样本分析显示，antagomiR-182-5p治疗组M1/M2巨噬细胞比率显著增加，CD8+T细胞活化标志物（CD69、Granzyme B和IFNγ）表达升高。在侵袭性更强的mT3-2D肿瘤模型中，联合使用miR-182-5p inhibitor和吉西他滨显示出增强的抗肿瘤反应。
研究结论与意义
本研究揭示了胰腺癌来源EVs通过递送miR-182-5p教育巨噬细胞向M2样免疫抑制表型极化的新机制。该过程涉及miR-182-5p靶向TLR4，进而激活JAK2/STAT3信号通路，导致PD-L1表达上调和免疫抑制性细胞因子分泌增加，最终抑制CD8+T细胞功能。靶向抑制miR-182-5p可逆转巨噬细胞极化，激活抗肿瘤免疫应答，抑制胰腺癌生长。该研究不仅阐明了胰腺癌免疫抑制微环境形成的重要机制，而且为开发针对miR-182-5p的胰腺癌免疫治疗新策略提供了理论依据和实验证据，具有重要的转化应用价值。
