抑制糖原合成酶激酶3通过caspase依赖途径减轻TDP-43介导的神经毒性

本研究针对肌萎缩侧索硬化(ALS)和额颞叶痴呆(FTD)中TDP-43蛋白病理这一关键问题，通过抑制GSK3激酶活性，系统阐明了其通过调控caspase依赖的TDP-43切割片段清除，改善TDP-43蛋白稳态并发挥神经保护作用的新机制。该发现为ALS-FTD谱系疾病提供了新的治疗策略。

在神经退行性疾病研究领域，肌萎缩侧索硬化(ALS)和额颞叶痴呆(FTD)是两种毁灭性的疾病，它们共享一个关键的病理特征：TAR DNA结合蛋白43 kDa(TDP-43)的异常聚集。在几乎所有的ALS病例和约一半的FTD病例中，患者的大脑和脊髓神经元内充斥着由TDP-43构成的泛素化包涵体。不仅如此，TDP-43的病理改变也见于阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病以及年龄相关的TDP-43脑病(LATE)中，凸显了TDP-43蛋白稳态失调在多种神经退行性疾病中的核心地位。TDP-43是一种重要的RNA结合蛋白，参与RNA剪接、转运和稳定性维持等多种细胞过程。其正常功能依赖于严格的剂量控制和正确的亚细胞定位，主要存在于细胞核内。然而，在疾病状态下，TDP-43错误地聚集在细胞质中，同时核内TDP-43水平下降。更关键的是，TDP-43会被caspase和calpain等蛋白酶切割，产生25 kDa、35 kDa和42 kDa的C末端片段，这些片段的积累和磷酸化是ALS-FTD的典型病理标志。尽管已知这些片段具有毒性，但调控其产生和清除的具体分子通路，以及它们如何驱动神经元死亡，仍不甚清楚。

糖原合成酶激酶3(GSK3)是一种广泛表达的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，参与多种细胞过程，包括代谢、增殖和凋亡。多项线索将GSK3与ALS-FTD病理联系起来：在散发性ALS患者的脊髓组织中GSK3表达升高；TDP-43的表达可以诱导GSK3活化；并且，在之前的一项果蝇模型筛选中，研究人员发现敲除GSK3的同源基因能显著抑制TDP-43引起的运动神经元退化。这些证据共同提示，GSK3活性的升高可能在TDP-43相关的神经变性中扮演着关键角色。那么，一个核心的科学问题便产生了：抑制GSK3能否在哺乳动物神经元中缓解TDP-43的毒性？如果能，其背后的分子机制又是怎样的？为了回答这些问题，由Matthew Anthony White、Leon Crowley、Jemeen Sreedharan等研究人员组成的研究团队在《Molecular Neurobiology》上发表了他们的研究成果。

研究人员综合运用了细胞生物学、分子生物学和神经科学等多学科技术方法。研究体系涵盖了人源SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞、原代大鼠皮质神经元、原代小鼠运动神经元以及人诱导多能干细胞(iPSC)来源的皮质神经元。关键技术包括：利用质粒转染在细胞中过表达野生型或突变型GFP标记的TDP-43蛋白；使用蛋白质印迹法(Western blot)分析TDP-43蛋白的切割片段、GSK3的表达和磷酸化水平；通过高内涵成像和自动化图像分析定量TDP-43在神经元核质中的分布；采用纵向荧光显微镜技术动态追踪原代神经元的存活情况；并应用实时定量PCR(qPCR)检测GSK3基因的转录水平变化。此外，研究还使用了药理学工具，如GSK3抑制剂CHIR99021和AZD1080，以及泛caspase抑制剂Q-VD-OPh，来特异性干预相关通路。

TDP-43 undergoes caspase-mediated cleavage

为了探究TDP-43与GSK3之间的机制联系，研究团队在SH-SY5Y细胞中表达了野生型TDP-43(TPD-43^WT)、ALS相关突变型TDP-43(TPD-43^Q331K)以及一个作为对照的N端缺失突变体(TPD-43^N-Del，缺失第1-81位氨基酸)。蛋白质印迹分析显示，表达TDP-43^WT或TDP-43^Q331K的细胞中除了全长蛋白外，还出现了一个约55 kDa的条带，其大小与TPD-43^N-Del相近。由于TPD-43^N-Del的截断点靠近caspase切割位点天冬氨酸89(Asp89)，研究人员推测该55 kDa条带是caspase切割产生的C末端片段。为了验证这一猜想，他们使用了泛caspase抑制剂Q-VD-OPh。结果发现，抑制caspase活性后，TDP-43^WT和TDP-43^Q331K的55 kDa片段显著减少，而全长蛋白的丰度相应增加。有趣的是，TPD-43^N-Del的丰度也因caspase抑制而增加，提示其保留的Asp89位点依然可以被切割。相反，当使用促凋亡剂staurosporine激活caspase时，TDP-43^WT和TDP-43^Q331K的切割显著增强，而一个切割位点突变体TDP-43^D89E则不受影响。这些结果证实，过表达的TDP-43确实会在其N端的核定位信号区内的Asp89位点发生caspase依赖性的切割，产生C末端片段。

TDP-43 truncation is dependent on its N-terminal caspase recognition motif

研究人员进一步确认了caspase活性与TDP-43加工之间的关系。他们发现，用staurosporine强烈激活caspase后，TDP-43^WT和TDP-43^Q331K的~55 kDa片段显著增加，而切割位点突变体TDP-43^D89E则不受影响。这表明TDP-43的截断严格依赖于其N端的caspase识别基序。

Selective activation of GSK3 by TDP-43 variants and inhibition by CHIR99021

接下来，研究团队探究了TDP-43对GSK3活性的影响。蛋白质印迹分析显示，与表达绿色荧光蛋白(GFP)的对照组相比，表达TDP-43^Q331K显著降低了GSK3α(Ser21)和GSK3β(Ser9)的抑制性磷酸化水平，表明这两种亚型都被激活。TDP-43^WT也显著降低了GSK3α的磷酸化，并对GSK3β有降低趋势。而TDP-43^N-Del对两种亚型的磷酸化均无显著影响，提示TDP-43激活GSK3可能需要其N端的二聚化结构域。反过来，当研究人员用小干扰RNA(siRNA)敲低内源性TDP-43后，GSK3α和GSK3β的抑制性磷酸化水平反而升高，且总GSK3蛋白水平下降。这表明TDP-43能动态调节GSK3的丰度和活性。随后，研究人员使用了GSK3抑制剂CHIR99021。出乎意料的是，CHIR99021处理不仅增加了GSK3α和GSK3β的抑制性磷酸化，还显著降低了总GSK3α和GSK3β的蛋白水平。在iPSC来源的人前脑神经元中，CHIR99021也观察到类似效果。进一步的qPCR实验表明，CHIR99021处理降低了GSK3A和GSK3B的mRNA水平，提示该抑制剂可能通过转录抑制和翻译后磷酸化双重机制来抑制GSK3功能。

GSK3 inhibition preferentially reduces the abundance of truncated TDP-43

一个关键的问题是，GSK3抑制能否影响TDP-43的片段化？研究人员发现，用CHIR99021或另一种GSK3抑制剂AZD1080处理表达TDP-43的SH-SY5Y细胞后，TDP-43^WT和TDP-43^Q331K的切割片段(~55 kDa)被选择性且显著地减少，而对全长蛋白的影响相对较小。TDP-43^N-Del的丰度也同样降低。更重要的是，当检测内源性TDP-43时，CHIR99021处理显著降低了其35 kDa切割片段的水平，而全长TDP-43没有明显变化。相反，过表达GSK3α或GSK3β则会增加内源性35 kDa片段的丰度。这些结果清晰地表明，GSK3的活性正向调节TDP-43的切割片段积累，而抑制GSK3则能促进这些片段的清除。

Inhibition of GSK3 reduces nuclear TDP-43 abundance through a caspase-dependant mechanism

TDP-43的核质分布异常是其病理学的核心特征。研究人员通过高内涵成像分析了原代大鼠皮质神经元中TDP-43-GFP的定位。他们发现，CHIR99021以剂量依赖的方式显著降低了TDP-43^WT和TDP-43^A315T在细胞核内的丰度，从而降低了核质TDP-43的比例。鉴于TDP-43主要定位于核内，GSK3抑制实际上降低了细胞中TDP-43的总量。为了探究caspase切割在此过程中的作用，他们在SH-SY5Y细胞中进行了联合药理学实验。结果显示，单独抑制caspase会增加所有TDP-43变体在核内的丰度，而单独抑制GSK3则降低TDP-43^N-Del和TDP-43^Q331K的核内水平。最关键的是，当同时使用caspase抑制剂时，CHIR99021降低核内TDP-43的能力被完全阻断。这表明GSK3通过一个依赖于caspase切割的机制来调控TDP-43的丰度。caspase在Asp89位点的切割可能破坏了TDP-43的核定位信号，从而影响其核输入或滞留，而GSK3则在此下游环节调控切割后片段的稳定性或清除。

Small molecule inhibition of GSK3 ameliorates TDP-43 toxicity

最后，也是最重要的问题是，GSK3抑制能否真正保护神经元免受TDP-43毒性的侵害？研究人员在多种神经元模型中验证了这一点。在原代大鼠皮质神经元中，表达TDP-43^WT或TDP-43^A315T显著增加了神经元的死亡风险，而CHIR99021处理则以特定浓度降低了这种风险。在原代小鼠运动神经元中，CHIR99021显著改善了表达TDP-43^Q331K的神经元的存活率。令人意外的是，原本作为阴性对照设计的TDP-43^N-Del也表现出轻微的毒性，这可能与其保留的C末端结构域有关，而GSK3抑制也能部分缓解其毒性。最终，在人iPSC来源的前脑神经元中，CHIR99021同样显著提高了表达TDP-43^WT或TDP-43^N-Del的神经元的存活率。这些结果一致表明，GSK3抑制的神经保护作用在不同物种（大鼠、小鼠、人）和不同神经元类型（皮质神经元、运动神经元）中是保守的，凸显了其在TDP-43蛋白病中的广阔治疗潜力。

1.0 indicates increased risk of death; HR<1.0 indicates reduced risk. a GFP-expressing neurons: GFP vs GFP+0.1μM CHIR, HR=1.1(sig-nificant). b TDP-43WT-expressing neurons: GFP vs TDP-43WT,HR=2.0; TDP-43WT vs TDP-43WT+0.1 uM CHIR, HR=0.7;TDP-43WT vs TDP-43WT+1.0μM CHIR, HR=0.8.c TDP-43A315T expressing neurons: GFP vs TDP-43A315T, HR=2.2; TDP-43A315T vs TDP-43A315T+0.1μM CHIR, HR=0.8; TDP-43A315T vs TDP-43A315T+1.0μM CHIR, HR=0.8. The number of individual neurons tracked for each risk-of-death analysis is shown. d Survival of pri-mary mouse motor neurons expressing TDP-43N-Del or TDP-43Q331K after treatment with CHIR. Pairwise comparisons: TDP-43N-Del,0.1μM CHIR,ns(P=0.2381);1.0μM CHIR,(P=0.0492);10μM CHIR,(P=0.0492). TDP-43Q331K, 0.1μM CHIR, ns(P=0.9825);1.0μM CHIR,(P=0.0312); 10μM CHIR,*(P=0.0026). For(d): n=3 biological replicates per condition; two-way ANOVA with Holm-Sidak post-hoc test. e Survival of iPSC-derived fore-brain neurons expressing GFP, TDP-43N-Del, or TDP-43WT after CHIR treatment. Pairwise comparisons(DMSO vs CHIR99021):GFP, ns(P=0.2381); TDP-43N-Del, ns(P=0.2381); TDP-43WT,ns(P=0.2381). For(e): n=3 biological replicates per condi-tion; multiple t-test with Holm-Sidak correction. Error bars denote mean±s.e.m">

本研究揭示了一个连接GSK3活性、TDP-43 caspase切割、蛋白稳态和神经毒性的关键通路。研究人员提出了一个模型：在生理状态下，TDP-43经历有限的caspase切割，产生的C末端片段被及时清除。而在病理条件下，TDP-43过表达等因素激活GSK3，后者可能通过抑制片段清除途径，导致毒性片段积累，从而触发神经元死亡。GSK3抑制则能打破这个恶性循环，恢复TDP-43的蛋白稳态，发挥神经保护作用。该研究不仅阐明了GSK3在TDP-43蛋白病中的一个新颖机制，更重要的是，它强有力地证明了靶向GSK3在ALS-FTD谱系疾病乃至其他TDP-43蛋白病中的治疗潜力。值得注意的是，研究中使用的GSK3抑制剂CHIR99021表现出多重作用机制，包括降低GSK3转录本和蛋白水平，以及增加其抑制性磷酸化，这为开发更有效的GSK3靶向疗法提供了新的思路。总之，这项研究将GSK3定位为TDP-43蛋白稳态的一个关键调控因子和极具前景的治疗靶点，为攻克这些目前无法治愈的神经退行性疾病带来了新的希望。