T3SS在人类肠道微生物组中的分布与特征
传统上，III型分泌系统（T3SS）被视为病原菌的核心毒力因子。然而，本研究通过对健康人肠道来源的Pseudomonadota（包括参考基因组和宏基因组组装基因组）进行分析，发现高达80%的菌株含有完整的T3SS。这些系统在Gammaproteobacteria中尤为常见，尤其是大肠杆菌（Escherichia coli）。人群队列分析显示，超过一半的健康个体肠道中定植着携带T3SS的菌株。
commensal效应蛋白与病原效应蛋白的显著差异
通过机器学习模型预测出3,002个候选效应蛋白。序列和结构分析表明，这些来自共生菌的效应蛋白与已知病原菌效应蛋白存在明显差异：仅有极少数（0.5%）与病原效应蛋白具有高序列相似性，FoldSeek结构聚类分析也显示，共生菌与病原菌的效应蛋白倾向于形成各自独立的同质结构簇，而非混合簇。域分析发现，共生菌效应蛋白中富含GGDEF、EAL（参与环二鸟苷酸信号转导）和PAS-fold（传感器）等结构域，这些在病原效应蛋白中罕见，提示其可能参与独特的细菌-宿主信号交流。
效应蛋白向人类细胞的注入功能验证
研究构建了包含910个效应蛋白ORF的人类微生物组效应蛋白ORFeome（HuMEOme_v1）。利用鼠伤寒沙门菌（Salmonella Typhimurium）作为异源表达系统，通过纳米荧光素酶报告系统验证了32个来自11个不同菌种的效应蛋白能够被特异性地注入HeLa细胞。更重要的是，在共生菌爱德华菌（Edwardsiella tarda）中，其自身的T3SS也能有效地将效应蛋白注入宿主细胞，证实了共生菌T3SS在生理条件下的功能活性。
微生物-宿主蛋白质相互作用meta-interactome图谱（HuMMI）的构建
为了系统揭示效应蛋白的功能，研究采用酵母双杂交（Y2H）系统大规模筛选了效应蛋白与人类蛋白质组的相互作用，绘制了人类微生物组meta-interactome图谱（HuMMI）。该图谱包含1,255个经过验证的相互作用，涉及286个效应蛋白和426个人类蛋白质。质量控制实验（包括酵母纳米荧光素酶双杂交yN2H和哺乳动物细胞共免疫沉淀）证实了互作数据的生物物理可靠性。网络拓扑分析揭示了效应蛋白对人类靶蛋白的“趋同靶向”现象，即来自不同菌种的不同效应蛋白倾向于靶向相同的人类蛋白质（如转录因子TCF4、NF-κB通路关键蛋白REL等），提示这些节点在微生物-宿主相互作用中具有核心重要性。
相互作用的结构基础与分子机制
AlphaFold-Multimer结构预测为部分相互作用对提供了结构模型。分析发现，效应蛋白可采取“相同界面”、“不同界面”或“重叠界面”与人类蛋白质结合。例如，多个效应蛋白靶向转录因子TCF4的不同结构域。此外，通过mimicINT流程和体外holdup assay实验，研究鉴定出大量由短线性 motifs（SLiMs）介导的相互作用，特别是效应蛋白C末端的PDZ结合基序（PBM）与人类PDZ域蛋白质的相互作用，揭示了另一种重要的分子识别机制。
效应蛋白靶向的功能通路与疾病关联
基因本体（GO）富集分析显示，效应蛋白的宿主靶点显著富集于免疫相关通路，尤其是NF-κB信号通路和SAPK/JNK通路。代谢模型分析也发现靶点中代谢酶有所富集。更为重要的是，网络邻居分析（基于人类参考相互作用组HuRI进行随机游走）表明，效应蛋白靶向的蛋白质网络邻居中，富含与多种疾病相关的遗传变异，包括自身免疫疾病（特别是克罗恩病）、代谢性疾病（如血脂水平）等。这与效应蛋白在NF-κB报告基因实验和肠道上皮细胞（Caco-2）细胞因子分泌实验中表现出的免疫调节功能相一致，部分效应蛋白能组成性激活或抑制NF-κB活性，并调节IL-6、IL-8等细胞因子的分泌。
效应蛋白在炎症性肠病（IBD）中的临床意义
对IBD患者宏基因组数据的分析揭示了令人惊讶的趋势：与健康对照组相比，克罗恩病（Crohn‘s disease）患者肠道中具有HuMMI互作能力的效应蛋白丰度显著增加，而在溃疡性结肠炎（ulcerative colitis）患者中则呈现减少趋势。HuMMI网络显示，一些在克罗恩病中富集的效应蛋白，其人类相互作用伙伴本身就是IBD的易感基因（如COG6、TNIP1），或与易感蛋白存在直接相互作用，这为两种IBD亚型提供了潜在的分子解释框架。
讨论与展望
本研究将T3SS的功能从传统的“毒力决定簇”拓展至微生物-宿主共生关系的重要媒介。健康人肠道中普遍存在的共生菌编码着功能性的T3SS，其效应蛋白库在序列、结构和功能上均与病原菌效应蛋白存在显著区别，更倾向于调节而非破坏宿主稳态。它们通过直接与宿主蛋白互作，特别是趋同靶向免疫信号通路的关键节点，构成了一个此前未被充分认识的微生物-宿主通讯层。这些相互作用与人类疾病的遗传易感性相交织，尤其在克罗恩病的发病机制中可能扮演重要角色。这项研究为从分子互作层面理解肠道微生物组如何影响人类健康与疾病开辟了新的道路。
