肝脏是结直肠癌（CRC）最常见的远处转移器官，肝转移是导致CRC患者死亡的主要原因。尽管治疗手段不断进步，但结直肠癌肝转移（CRCLM）患者的临床预后仍然不佳。因此，深入理解CRCLM的分子机制对于开发有效的预防和治疗策略至关重要。在肝脏肿瘤微环境中，肝星状细胞（HSC）是肝脏特有的周细胞，正常状态下处于静息状态。然而，在CRCLM过程中，HSC被肿瘤来源的信号激活，成为癌症相关成纤维细胞（CAF）的主要来源。这些HSC来源的CAF通过沉积细胞外基质（ECM）蛋白、分泌细胞因子和生长因子，并创造免疫抑制性肿瘤微环境来加速肿瘤定植，从而重塑肝脏转移前微环境。转化生长因子β（TGF-β）是肝脏肿瘤微环境中含量丰富的组分，是激活HSC为CAF的最有效因子之一。TGF-β通过激活TGF-β信号级联反应诱导HSC活化，包括在质膜（PM）上连接TGF-β受体II（TβRII）和TGF-β受体I（TβRI），磷酸化SMAD2/3，在细胞质中诱导SMAD2/3/4复合物形成，并将SMAD复合物转运至细胞核进行基因转录。由于TβRII是信号级联的启动子，其PM定位、内化、运输和降解在HSC活化中起着决定性作用。然而，TβRII结合蛋白如何调节HSC活化尚不完全清楚。
为了回答TGF-β刺激的HSC活化机制问题，研究人员开展了此项研究。他们通过免疫共沉淀结合质谱分析，在原发性人HSC和水生化LX2细胞中鉴定出TUFT1（Tuftelin 1）是一种新型的TβRII结合蛋白。机制上，TUFT1通过其氨基酸片段（a.a. 1–86, 87–157）与TβRII相互作用，竞争性地破坏caveolin-1（CAV1）与TβRII的结合，从而将TβRII从CAV1介导的降解途径中解救出来，并将其分选进入内体介导的运输和信号通路，保护TβRII免遭溶酶体降解，进而促进TGF-β信号传导和HSC的肌成纤维细胞活化。临床方面，研究证实TUFT1在患者来源的CRCLM组织的CAF中表达。在HSC/CRC共植入和小鼠门静脉肿瘤注射模型中，靶向HSC中的TUFT1可抑制HSC活化，并限制CRC在皮下和肝脏部位的生长。该研究揭示了TUFT1在肝脏肿瘤微环境中的新功能，强调其通过促进TβRII蛋白稳定性，作为HSC活化和促转移肝微环境的关键调节剂的作用。靶向HSC中的TUFT1为对抗CRCLM提供了一种有前景的治疗策略。相关研究成果发表在《CELL DEATH AND DIFFERENTIATION》期刊上。
研究人员为开展此项研究，运用了几个关键的技术方法。他们利用免疫共沉淀结合质谱（IP-MS）技术鉴定了TUFT1是TβRII的结合蛋白。通过构建短发夹RNA（shRNA）敲低TUFT1表达，并利用蛋白质印迹（WB）、免疫荧光（IF）、共聚焦显微镜等技术，在原发性人HSC和LX2细胞系中验证了TUFT1对TβRII蛋白稳定性及TGF-β信号通路的影响。研究还采用了细胞表面生物素化实验、溶酶体和蛋白酶体抑制剂处理、蛋白质半衰期测定、免疫共沉淀（Co-IP）检测蛋白质相互作用和泛素化水平。此外，通过染色质免疫共沉淀（ChIP）和荧光素酶报告基因实验证实了TGF-β/SMAD信号对TUFT1的转录调控。体内功能研究则利用了HSC/CRC细胞共植入皮下瘤模型、条件性基因敲除小鼠（TUFT1flox/flox Col1a2-CreER小鼠）以及门静脉注射MC38细胞构建的CRCLM模型。临床样本方面，研究使用了来自西安交通大学第一附属医院的18例CRC患者配对的CRCLM组织和癌旁正常肝组织分离的CAF和HSC。生物信息学分析包括对公共单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据和空间转录组数据的再分析，以验证TUFT1在不同细胞类型中的表达。
TUFT1被鉴定为HSC中TβRII的结合蛋白
研究人员通过免疫共沉淀结合质谱分析，在过表达TβRII-HA融合蛋白的原代人HSC中，鉴定出TUFT1是TβRII的一个新型结合蛋白。随后的Co-IP实验证实，内源性TUFT1与过表达的TβRII-HA在原代人HSC和LX2细胞中发生共沉淀，反之，过表达的TUFT1-3×Flag也能沉淀内源性TβRII。内源性蛋白质的Co-IP进一步验证了TβRII与TUFT1在HSC中的相互作用。双标免疫荧光显示TβRII-HA与TUFT1在HSC的质膜和内体中共定位。
TUFT1在患者CRCLM的活化HSC/CAF中表达
组织学分析显示，在患者CRCLM样本中，α-SMA（活化的HSC/CAF标志物）与TUFT1的免疫荧光信号共定位，表明TUFT1蛋白在CAF中表达。空间转录组学分析公共数据发现，在CRCLM的基质细胞中，CAF的TUFT1转录本水平最高。蛋白质印迹证实，与配对的癌旁正常肝组织中的HSC相比，患者CRCLM组织中分离的CAF的TUFT1和TβRII蛋白水平均显著上调，且两者表达呈正相关。
靶向TUFT1降低TβRII蛋白稳定性并促进其溶酶体降解
在原代人HSC和LX2细胞中敲低TUFT1后，TβRII的蛋白水平显著降低，但TβRI蛋白水平不变。有趣的是，TUFT1敲低反而上调了TβRII的mRNA水平，提示TUFT1可能在翻译后水平调节TβRII。蛋白质合成抑制剂环己酰亚胺（CHX）追踪实验表明，TUFT1敲低显著缩短了TβRII的蛋白半衰期。使用溶酶体抑制剂（Bafilomycin A1或E64d+ Pepstatin A）处理可以恢复TUFT1敲低细胞中TβRII的蛋白水平，而蛋白酶体抑制剂MG132则无此效果。免疫荧光显示，TUFT1敲低增强了TβRII-HA与溶酶体标志物LAMP1的共定位。Co-IP实验进一步证明，TUFT1敲低增强了TβRII的泛素化水平。这些结果表明，靶向TUFT1通过促进TβRII的泛素化和溶酶体降解途径来下调其蛋白水平。
TUFT1通过竞争CAV1结合来保护TβRII
研究发现，TUFT1敲低并不影响CAV1的mRNA和蛋白水平。然而，Co-IP和免疫荧光实验显示，TUFT1敲低增强了TβRII与CAV1的结合及共定位，而过表达TUFT1则抑制了这种结合。相反，敲低CAV1则增强了TβRII与早期内体标志物EEA1的共定位。这些结果说明，TUFT1通过与CAV1竞争性结合TβRII，将TβRII从脂筏/小窝介导的降解途径中解救出来，转而导向内体介导的循环和信号通路，从而稳定TβRII。截断体实验表明，TUFT1的N端氨基酸1-157片段（包含a.a. 1-86和87-157两个区域）负责与TβRII的胞内结构域结合，并且该片段足以恢复TUFT1敲低导致的TβRII蛋白水平下降和SMAD信号减弱。
TUFT1敲低改变HSC的TGF-β转录组并抑制其活化
RNA测序分析显示，在TGF-β1刺激的HSC中，TUFT1敲低改变了1858个转录本的表达，其中690个是TGF-β1诱导且TUFT1依赖的差异表达基因。这些基因富集在ECM组织、跨膜受体丝氨酸/苏氨酸激酶信号通路、间充质发育等生物学过程。TUFT1敲低抑制了TGF-β1诱导的HSC活化标志物（如α-SMA, CTGF, Fibronectin, Collagen I）的表达以及SMAD2/3的磷酸化和核转位。条件培养基实验表明，TUFT1敲低HSC的条件培养基对CRC细胞（HT29, HCT116）的增殖、迁移、侵袭和上皮-间质转化（EMT）的促进作用减弱。这些效应可通过在TUFT1敲低细胞中重新过表达TβRII-HA而部分恢复。
TGF-β1/SMAD信号转录上调TUFT1表达
研究人员发现，TGF-β1刺激可上调HSC中TUFT1的mRNA和蛋白水平。荧光素酶报告基因实验表明，TGF-β1可增强TUFT1启动子的活性。ChIP-qPCR实验证实，在TGF-β1刺激下，SMAD2/3蛋白可直接结合到TUFT1的启动子区域。这表明TUFT1本身是TGF-β/SMAD信号通路的一个转录靶标，从而在HSC中形成了一个正反馈环路，强化其活化。
靶向HSC TUFT1抑制小鼠体内CRC生长和肝转移
在体内功能实验中，将HT29 CRC细胞与对照HSC或TUFT1敲低HSC共植入裸鼠皮下，发现TUFT1敲低HSC对HT29肿瘤生长的促进作用显著减弱。肿瘤组织中CAF密度（α-SMA阳性）以及HSC来源的促肿瘤因子（如COMP, CTGF, IGFBP3, LIF）水平均降低。更重要的是，利用TUFT1flox/flox Col1a2-CreER条件性基因敲除小鼠（他莫昔芬诱导后特异性在HSC中敲除TUFT1），在门静脉注射MC38 CRC细胞构建的CRCLM模型中，发现与对照TUFT1flox/flox 小鼠相比，条件性敲除小鼠的肝脏转移瘤负荷显著减轻，转移瘤中CAF活化程度及相关促肿瘤因子表达也明显下降。
研究结论与意义
本研究首次发现并阐明了TUFT1在肝星状细胞活化及结直肠癌肝转移中的关键作用及分子机制。TUFT1作为TβRII的新型结合蛋白，通过竞争性抑制CAV1与TβRII的结合，阻止TβRII进入脂筏/小窝介导的降解途径，从而稳定TβRII蛋白，增强TGF-β/SMAD信号通路，最终驱动HSC活化为促进转移的CAF。此外，TUFT1本身受TGF-β/SMAD信号通路上调，形成了一个正反馈循环，持续放大HSC的活化信号。研究在细胞模型、患者组织样本以及多种小鼠体内模型（皮下共植入模型和门静脉注射肝转移模型）中均验证了靶向HSC中的TUFT1能够有效抑制HSC活化、CAF功能以及CRC的肝转移。
该研究的创新性在于揭示了TUFT1在肝脏肿瘤微环境，特别是HSC活化过程中的全新功能，并阐明了一条精细调控TβRII蛋白稳定性和信号传导的新机制（TUFT1竞争性拮抗CAV1）。这一发现不仅深化了对TGF-β受体 trafficking 和降解调控网络的理解，而且将TUFT1确立为干预HSC活化和CRCLM的一个潜在新靶点，为开发针对肿瘤基质、改善CRCLM预后的治疗策略提供了重要的理论依据和实验证据。
打赏
