1 引言
肿瘤微环境（TME）在治疗抵抗和癌症进展中的关键作用已被广泛认识。然而，癌细胞与TME中其他细胞类型（如肿瘤相关巨噬细胞，TAMs）之间复杂的“串扰”严重限制了传统疗法的效果。因此，识别TME中癌细胞和其他促癌细胞类型的共同治疗靶点，并设计共靶向策略迫在眉睫。TAMs是各种实体瘤中的主要非癌细胞类型，在肿瘤生长、耐药、血管生成和转移中起关键作用。MicroRNA-21-5p（miR-21）是癌细胞中最常过表达的miRNA，作为癌基因通过抑制多个肿瘤抑制因子来促进耐药、肿瘤生长和转移。此外，miR-21通过调节癌细胞与TAMs等TME中其他细胞类型的“串扰”来促进癌症进展。细胞外囊泡（EVs）作为小核酸药物递送载体具有巨大潜力。乳源细胞外囊泡（mEVs）因其低成本、易获得和高安全性而更具吸引力。纳米抗体作为一种单域抗体，易于生产，并表现出优异的组织穿透性、结构稳定性和靶点亲和力。表皮生长因子受体（EGFR）在各种实体癌中频繁过表达，而免疫检查点分子PD-L1在肿瘤细胞和一些免疫细胞（尤其是TAMs）中异常上调。因此，用EGFR和/或PD-L1特异性纳米抗体修饰的药物载体为同时靶向表达这些标志物的肿瘤细胞和TAMs提供了一种可行的方法。
2 材料与方法
本研究使用了多种细胞系（如NCM460、HCT116、CT26、THP-1等）和BALB/c、C57BL/6小鼠模型。通过蛋白质印迹、定量逆转录PCR（qRT-PCR）、流式细胞术（FCM）等方法进行了分子和细胞水平验证。纳米抗体（7D12和KN035）和分选酶A（SrtA）通过原核表达和蛋白质纯化获得。mEVs从新鲜牛奶中通过等电点沉淀和超速离心分离，并通过电穿孔加载miR-21抑制剂。通过SrtA介导的酶促连接将纳米抗体修饰到负载miR-21抑制剂的mEVs上，制备了单靶向（7D12-iEV, KN035-iEV）和双靶向（7D12/KN035-iEV）的工程化mEVs。通过纳米颗粒跟踪分析（NTA）、动态光散射（DLS）和透射电子显微镜（TEM）对工程化mEVs进行了表征。通过体外细胞摄取、增殖、凋亡、集落形成、巨噬细胞吞噬活性、T细胞活化和患者来源的肿瘤样细胞簇（PTC）模型评估了工程化mEVs的功能。在荷瘤小鼠模型中评估了体内生物分布、抗肿瘤效果和安全性，并进行了批量RNA测序和单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析。
3 结果
3.1 TME中EGFR、PD-L1和miR-21的表达分析
单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析证实，EGFR和PD-L1分别在肿瘤细胞和TAMs中 predominant 表达。在人和小鼠结直肠癌（CRC）细胞及其相应的TAMs中，EGFR和PD-L1的表达水平相对高于正常肠上皮细胞或巨噬细胞。CRC患者中PD-L1和EGFR高表达与较差预后相关。通过文献筛选和实验验证，确定miR-21在HCT116细胞和HCT116诱导的TAMs中高表达，且其抑制剂能有效抑制M2标志物CD206的表达并诱导肿瘤细胞凋亡，支持了通过靶向EGFR和PD-L1向肿瘤细胞和TAMs递送miR-21抑制剂的可行性。
3.2 成功制备纳米抗体工程化mEVs
成功从牛奶中分离出mEVs，并表达了SrtA、7D12和KN035蛋白。通过电穿孔将miR-21抑制剂加载到mEVs中，然后通过SrtA介导的转肽作用将纳米抗体连接至mEVs表面，成功构建了单靶向和双靶向的工程化mEVs。表征结果显示纳米抗体修饰的mEVs尺寸略有增加，但仍在正常EVs尺寸范围内，且均匀性高，稳定性增强。
3.3 纳米抗体工程化mEVs显示出增强的靶向能力
双靶向mEVs（7D12/KN035-iEV）在TAMs和表达EGFR及/或PD-L1的癌细胞中的摄取效率显著高于未修饰的mEVs或单靶向mEVs，证实了其双靶向能力。
3.4 纳米抗体工程化mEVs在体外有效诱导TAM重编程
负载miR-21抑制剂的工程化mEVs能恢复TAMs中PTEN和SOCS1（miR-21的关键靶标）的表达，并抑制PD-L1表达，将TAMs复极为M1样巨噬细胞。纳米抗体修饰，特别是双修饰，显著增强了iEVs的效果。经处理的TAMs吞噬肿瘤细胞的能力显著增强，并促进了CD8+T细胞的增殖和活性。
3.5 纳米抗体工程化mEVs的体外抗癌效果
纳米抗体工程化mEVs在多种表达相应靶蛋白的癌细胞中显示出增强的增殖抑制活性。双靶向mEVs在共表达EGFR和PD-L1的癌细胞（如HCT116, CT26）中表现出最强的细胞毒活性和凋亡诱导作用。在患者来源的肿瘤样细胞簇（PTC）模型中，7D12/KN035-iEV对高表达PD-L1、EGFR和miR-21的PTCs生长抑制效果最强，而在低表达或不表达这些靶点的模型中效果不佳，突出了其靶向依赖性。
3.6 纳米抗体工程化mEVs的体内生物分布
在CT26荷瘤小鼠模型中，纳米抗体修饰的mEVs，特别是7D12/KN035-iEV，在肿瘤组织中的积累显著高于未修饰mEVs。免疫荧光证实7D12-mEV主要定位于肿瘤细胞，KN035-mEV主要定位于TAMs，而7D12/KN035-mEV对两种细胞均有更强的定位。
3.7 纳米抗体工程化mEVs的体内抗肿瘤效果
在CT26和B16荷瘤小鼠模型中，纳米抗体工程化mEVs显示出比未修饰iEVs更强的肿瘤抑制效果，7D12/KN035-iEV组抑制率最高（CT26模型85.7%，B16模型84.9%）。治疗组肿瘤中miR-21和PD-L1表达下降，而其靶基因（PTEN, PDCD4, SOCS1）表达上调。7D12/KN035-iEV治疗能有效将TAMs复极为M1巨噬细胞，并增加肿瘤内CD8+T细胞的比例和活性，增强凋亡和坏死，减少增殖。安全性评估显示工程化mEVs具有良好的生物安全性。
3.8 7D12/KN035-iEV与抗PD-1和放疗协同引发强效抗肿瘤作用
放疗可上调肿瘤细胞和TAMs中的PD-L1表达。在CT26荷瘤模型中，7D12/KN035-iEV与放疗或抗PD-1抗体联用显示出显著的协同抗肿瘤效应，肿瘤抑制率分别达到93.7%和94.3%，并进一步增强了抗肿瘤免疫。即使在微卫星稳定（MSS）且对ICB耐药的模型中，联合治疗也能有效逆转免疫抑制性TME。
3.9 7D12/KN035-iEV重编程TAMs并在TME中引发抗癌免疫
批量RNA-seq和scRNA-seq分析表明，7D12/KN035-iEV治疗激活了T细胞受体信号、免疫细胞趋化、炎症反应、TNF信号和凋亡等多种与炎症和抗肿瘤效应相关的通路。在单细胞水平上，治疗导致癌细胞中致癌通路活性降低，抗癌通路激活，增殖减少，凋亡增加。TAMs向促炎M1表型复极，CD8+T细胞比例增加，Tregs比例减少，CD8+T细胞抗肿瘤活性增强。伪时间分析提示治疗诱导T细胞向细胞毒性CD8+T细胞分化。
4 讨论
本研究开发了一种双靶向mEV纳米药物（7D12/KN035-iEV），可特异性递送miR-21抑制剂至表达EGFR和/或PD-L1的癌细胞和TAMs，从而发挥强大的抗癌作用。该纳米药物不仅直接抑制肿瘤细胞增殖，还通过重编程TAMs和重塑TME间接抑制癌症生长。此外，它与放疗和ICB等其他疗法联用显示出强大潜力。该双靶向mEV纳米药物展示了显著的抗肿瘤活性和生物安全性，为癌症治疗提供了一个强大且多功能的平台。其适配性允许通过更换靶向配体和治疗载荷应用于更广泛的疾病。
