1 引言
免疫细胞来源的人工细胞衍生囊泡(ACDVs)代表了一种利用人体自身防御机制靶向清除癌细胞的前沿癌症治疗策略。CD8+细胞毒性T细胞和自然杀伤(NK)细胞通过穿孔素/颗粒酶(perforin/granzyme)途径以及Fas配体(FasL)和TRAIL途径这两种强效机制根除癌细胞。ACDVs能够封装这些天然的细胞毒性分子，形成生物相容性良好的靶向治疗剂。
生物工程化的纳米囊泡(NVs)源自T细胞和NK细胞，能模拟亲代免疫细胞的特性，特异性摧毁癌细胞。其应用优势在于固有的生物相容性、较低的免疫原性以及穿越血脑屏障和肿瘤微环境(TME)等生物屏障的能力。此外，NVs的多功能性可通过遗传和表面修饰以及化疗药物装载来增强，从而实现癌细胞的精确靶向，同时最大限度地减少脱靶效应和毒性。
然而，天然免疫细胞来源的NVs的生产面临挑战，其分离和纯化过程复杂且成本高昂，难以满足临床需求。因此，能够以更高产量生产的免疫细胞来源的ACDVs成为一种有前景的替代方案。为了增强天然细胞来源NVs的细胞毒性能力，目前正通过基因工程改造免疫细胞（表达嵌合抗原受体和肽）或通过使用无铜点击化学技术进行表面修饰来创建靶向版本。
应变促进的叠氮-炔环加成(SPAAC)反应作为一种无铜点击化学，因其特异性、高反应速率、小分子尺寸和生物相容性而在细胞工程和生物共轭中广受欢迎。NVs表面蛋白的赖氨酸残基可用叠氮部分修饰，并通过SPAAC与二苯并环辛炔(DBCO)标记的抗体结合，从而增强靶向能力。
本研究描述了从活化T细胞和NK92细胞生产、表征和比较与肿瘤靶向抗体（尼妥珠单抗和14f7hT）结合的ACDVs。尼妥珠单抗是一种人源化单克隆抗体，用于治疗表达表皮生长因子受体(EGFR)的各种癌症。人源化单克隆抗体14f7hT靶向N-羟乙酰神经氨酸(Neu5Gc) GM3神经节苷脂，这是一种外源抗原，可被多种癌细胞摄取。本研究报道了一种在活化T细胞和NK92细胞来源的ACDVs上展示肿瘤靶向抗体的方法，并比较了抗体结合的活化T细胞ACDVs (T-ACDVs)和NK92细胞ACDVs (NK92-ACDVs)的特性。
2 材料与方法
2.1 细胞培养
从健康捐献者获取原代人T细胞，通过Ficoll-Hypaque分离人外周血单核细胞(PBMCs)，并使用阳性磁选试剂盒分离CD4+/CD8+T细胞。T细胞在含有重组IL-2的ImmunoCult培养基中培养，并使用ImmunoCult CD3/CD28 T细胞激活剂试剂扩增。NK-92细胞在含有IL-2等多种补充剂的Alpha最低必需培养基中培养。L1210细胞在含有马血清的DMEM中培养，SK-OV-3细胞在含有胎牛血清(FBS)的RPMI 1640培养基中培养。
2.2 动物实验
使用4-6周龄的NOD scid gamma (NSG)雌性小鼠，所有实验均按照大学动物护理委员会(UACC)指南进行。
2.3 抗体标记与ACDVs制备
尼妥珠单抗和14f7hT抗体用DBCO-PEG4-NHS酯标记。通过声波破碎法制备ACDVs，细胞悬液在冰浴中超声处理，离心后收集粗制纳米囊泡。粗制ACDVs用6-叠氮己酸NHS酯(NHS-Az)处理，标记叠氮，然后通过超速离心(UCF)在碘克沙醇梯度下纯化，得到叠氮修饰的纳米囊泡(ACDV-Azs)。随后，ACDV-Azs通过SPAAC反应与DBCO修饰的抗体结合，并再次通过UCF纯化，得到抗体结合的ACDVs。
2.4 ACDVs表征
通过动态光散射(DLS)和透射电子显微镜(TEM)表征抗体结合和未结合的ACDVs的流体动力学直径和形态。通过流式细胞术，将ACDVs固定在醛/硫酸盐乳胶微珠上，检测抗体结合情况以及穿孔素、颗粒酶B、FasL和TRAIL的表达。
2.5 体外实验
通过流式细胞术评估抗体结合的ACDVs与抗原阳性癌细胞（L1210和SK-OV-3）的相互作用。细胞毒性通过7-AAD染色（针对L1210）或使用IncuCyte活细胞成像系统监测GFP荧光强度（针对SK-OV-3）来评估。使用pHAb染料标记的ACDVs并通过流式细胞术测量平均荧光强度(MFI)的变化来评估ACDVs的内化。
2.6 体内及离体实验
在SK-OV-3异种移植NSG小鼠模型中，评估NK92-ACDV-尼妥珠单抗的体内疗效。在慢性淋巴细胞白血病(CLL)患者活检中，评估NK92-ACDV-14f7hT对14f7hT阳性CLL细胞的离体细胞毒性。
3 结果
3.1 ACDVs的生产与表征
成功从活化T细胞和NK92细胞生成ACDVs。抗体结合的T-ACDVs和NK92-ACDVs的流体动力学直径范围约为198-259 nm，多分散指数(PI)小于0.5。TEM显示其为具有脂质双层的单层结构，抗体结合未影响其结构完整性。流式细胞术证实了抗体成功结合至ACDVs表面。T-ACDVs保留了穿孔素、颗粒酶B、FasL和TRAIL，而NK92-ACDVs保留了穿孔素、颗粒酶B和FasL，但未检测到TRAIL。
3.2 特异性结合与细胞相互作用
14f7hT或尼妥珠单抗结合的T-ACDVs和NK92-ACDVs与抗原阳性癌细胞（L1210和SK-OV-3）的相互作用显著增强，平均荧光强度(MFI)较未靶向ACDVs提高数倍。
3.3 体外细胞毒性
抗体靶向显著增强了ACDVs的细胞毒性。14f7hT结合的T-ACDVs和NK92-ACDVs对L1210细胞的杀伤率分别达到43.1%和45.8%，显著高于未靶向组。尼妥珠单抗结合的ACDVs对SK-OV-3细胞也表现出更强的杀伤效果。值得注意的是，未靶向的NK92-ACDVs对SK-OV-3的细胞毒性高于未靶向的T-ACDVs，且与靶向的T-ACDVs效果相当，而靶向的NK92-ACDVs和T-ACDVs杀伤效果相似。
3.4 内化作用
尼妥珠单抗结合显著加快了T-ACDVs和NK92-ACDVs被SK-OV-3细胞内化的速率。
3.5 体内疗效
在SK-OV-3异种移植模型中，NK92-ACDV-尼妥珠单抗治疗显著抑制了肿瘤生长，延长了小鼠生存期，且对小鼠体重无显著影响，表明其安全性。
3.6 离体疗效
在CLL患者活检中，NK92-ACDV-14f7hT对14f7hT阳性CLL细胞的杀伤作用显著强于未靶向的NK92-ACDVs。
4 讨论
本研究证实了声波破碎法可高效生产保留亲代细胞毒性分子（穿孔素、颗粒酶、死亡配体）的免疫细胞来源ACDVs。利用SPAAC化学进行抗体靶向修饰是一种有效策略，能显著增强ACDVs的靶向性、内化和疗效。与T-ACDVs相比，NK92-ACDVs虽然检测到的死亡配体种类较少，但显示出不逊色甚至更强的细胞毒性，这可能与NK92细胞特有的表面受体（如自然细胞毒性受体）有关。NK92细胞易于扩增，具有临床转化潜力。体内外实验均证明了抗体靶向ACDVs，特别是NK92-ACDVs的有效性。尽管免疫细胞来源的外泌体具有治疗潜力，但其产量、异质性和靶向效率存在局限。抗体结合的ACDVs提供了一种更可控、高效的方法，有望成为天然外泌体的有前景的替代品，用于治疗性递送。
