背景
胆道癌（BTC）作为一种起源于胆管上皮细胞的恶性肿瘤，以其侵袭性和不良预后为特征。肿瘤细胞与免疫系统之间的相互作用受到广泛关注，特别是程序性死亡配体1（PD-L1）等免疫检查点分子。PD-L1在肿瘤相关免疫浸润细胞中的表达是影响肿瘤进展和免疫逃逸的关键因素，直接影响免疫反应和免疫靶向治疗的疗效。PD-L1是免疫检查点通路的关键组成部分，通过与其受体PD-1结合，导致抗肿瘤免疫反应抑制。在胆道癌中，PD-L1由恶性细胞和肿瘤浸润免疫细胞（TIICs）表达，这些免疫浸润主要包括CD8+细胞毒性T淋巴细胞、调节性T细胞（Tregs）和髓系来源的抑制性细胞（MDSCs），它们在塑造肿瘤微环境的免疫景观中发挥关键作用。
除免疫逃逸外，PD-L1表达对靶向免疫治疗的发展具有重要意义。免疫检查点抑制剂的引入改变了癌症治疗格局，包括胆道癌。临床试验显示胆道癌患者对PD-1/PD-L1阻断的反应存在差异，强调需要更全面地了解肿瘤微环境和PD-L1动态以提升治疗效果。TIICs中的PD-L1表达可能作为预测患者对免疫治疗反应的潜在生物标志物。在免疫治疗疗效的预测标志物中，中性粒细胞-淋巴细胞比值（NLR）作为与治疗结果相关的潜在生物标志物受到关注。NLR源自外周血，反映了免疫系统两个关键组分——中性粒细胞和淋巴细胞之间的平衡。NLR升高与包括胆道癌在内的多种恶性肿瘤的不良预后相关。
方法
本研究为回顾性研究，纳入2017年1月1日至2020年1月1日期间中山大学肿瘤防治中心胰腺肝胆外科的239例患者。对这些患者的病理组织切片进行TIICs上PD-L1的免疫组织化学分析。PD-L1表达采用两种互补的评分系统进行评估：肿瘤比例评分（TPS）和联合阳性评分（CPS）。TPS代表PD-L1阳性肿瘤细胞占所有存活肿瘤细胞的百分比，而CPS同时考虑肿瘤细胞和肿瘤相关免疫细胞中的PD-L1表达，提供对肿瘤免疫微环境更全面的评估。根据国际公认的CPS-TPS系统定义TIICs的PD-L1阳性，按照队列的中位CPS-TPS值将患者分为TIICs PD-L1高表达组和低表达组。
在随访期间收集临床数据，包括总生存期（OS）、无病生存期（DFS）和病理学结果。收集的数据进行统计分析以检查与研究目标相关的结果。此外，利用癌症基因组图谱（TCGA）数据库研究PD-L1的表达谱及相关信息。
结果
TCGA数据库的免疫学分析显示，与低CD274表达样本相比，高CD274表达样本在活化树突状细胞（aDC）、B细胞、CD8 T细胞、树突状细胞（DC）、T辅助细胞、调节性T细胞（TReg）和中性粒细胞等多种免疫细胞类型的富集分数上存在显著差异。高CD274表达与大多数免疫细胞类型较高的富集分数相关。CD274表达与免疫细胞组成和免疫检查点活性密切相关，特别是与调节性T细胞、树突状细胞和巨噬细胞呈显著正相关。
免疫组化染色显示，PD-L1阳性样本在免疫或肿瘤相关细胞中表现出更明显的棕褐色染色，表明这些区域PD-L1活性较高。PD-L1阳性样本的TIICs评分显著高于阴性样本。NLR的受试者工作特征（ROC）曲线分析显示，术前NLR和复发后NLR具有中等预测能力，而术后NLR和复发前NLR预测价值较低。
患者队列特征显示，239例患者中男性137例（57.3%），女性102例（42.7%），中位年龄62岁。肝内胆管癌是最常见的癌症类型（54%）。大多数患者为T1期肿瘤（44.7%），淋巴结分期显示68.4%为N0，94.5%为非转移性（M0）。TNM分期显示大多数患者为II期（37%）。术前CA199水平>35的患者占56.9%。
按TIICs的PD-L1表达分层显示，两组在性别分布、年龄或癌症类型方面无显著差异。神经浸润在高PD-L1表达组中发生率更高。肿瘤分期无显著差异，而转移分期接近显著性，低PD-L1表达组中M0病例比例更高。
单变量和多变量分析确定了几种与胆道癌患者OS相关的因素。多变量分析中，仅转移（M1）和术前CA199水平成为OS的强独立预测因子。转移与死亡风险增加相关，而术前CA199水平升高与较差的生存率相关。TIICs的PD-L1表达对生存率无显著影响。
DFS分析显示，血管肿瘤血栓、分化程度、淋巴结分期和术前CA199水平与DFS显著相关。多变量分析确定分化程度和术前CA199水平是DFS的重要预测因子。中度分化肿瘤和高度分化肿瘤与改善的DFS结局相关，而术前CA199水平升高与较差的DFS结局相关。
Kaplan-Meier生存曲线分析各种临床和生物学因素对胆道癌患者DFS和OS的影响。TIICs上高、低PD-L1表达患者的DFS和OS无显著差异。格拉斯哥评分各组间生存率也无显著差异。而手术前一周和手术后一个月的高NLR与较短的DFS和降低的OS显著相关。
在不同治疗条件下胆道癌患者OS的Kaplan-Meier分析中，复发前一个月和复发后一个月的高NLR与较差的OS结局相关。在复发后免疫治疗亚组（n=35）的探索性分析中，TIICs上高PD-L1表达可能与较差的OS相关。格拉斯哥评分对OS的影响在复发后接受或未接受免疫治疗的患者中均无显著差异。高NLR患者无论是否接受免疫治疗，OS均无显著差异。
讨论
TIICs上PD-L1表达的检查以及NLR对胆道癌复发后免疫治疗结果的影响呈现出一个复杂的景观，对治疗策略具有潜在意义。表现出高PD-L1表达的肿瘤产生复杂的免疫微环境，其特征是免疫激活和抑制之间的微妙平衡。在胆道癌等恶性肿瘤中，这种双重性具有特殊相关性，其中肿瘤逃避免疫监视的能力在其进展中起关键作用。
在我们的队列中，TIICs上高PD-L1表达与免疫治疗后较差的生存率相关，这可能反映了与肿瘤细胞本身PD-L1不同的免疫调节机制。观察到的高PD-L1组生存率较差趋势需要在更大的前瞻性队列中验证。最近的数据表明，定位于免疫或基质区的PD-L1表达与免疫抑制微环境相关，可能预测不良结局。
除PD-L1表达外，NLR已成为反映胆道癌全身炎症和免疫功能障碍的重要预后生物标志物。NLR升高表明存在促炎状态，与较差的生存结局相关，并可能对免疫治疗效果产生不利影响。NLR与免疫治疗的关系尤其值得注意，因为炎症已被证明通过招募促肿瘤免疫细胞影响肿瘤微环境，可能降低免疫检查点抑制剂的疗效。
NLR作为预测免疫治疗反应的生物标志物的潜力强调需要进一步研究以阐明其在胆道癌局部和全身免疫反应中的作用。对NLR的调查研究仍处于起步阶段。尽管已观察到这些因素与患者结局之间存在显著相关性，但它们在预测免疫治疗效果方面的确切作用仍不明确。个体患者对免疫治疗反应的变异性，加上肿瘤微环境的异质性，使这些标志物作为可靠预测因子的使用复杂化。
更全面地了解NLR、肿瘤免疫原性以及免疫细胞招募和激活之间的关系，可能会增强NLR作为胆道癌治疗预测生物标志物的可靠性。将NLR与其他免疫学参数（如肿瘤突变负荷（TMB）和微卫星不稳定性（MSI））结合，可能提供对患者潜在免疫治疗反应的更精确评估。此外，将C反应蛋白（CRP）等其他炎症标志物与NLR结合，可以更全面地了解炎症状态和免疫反应。
需要进一步研究以阐明全身炎症（通过NLR测量）影响肿瘤免疫微环境并影响治疗结果的机制。评估免疫治疗与减轻全身炎症策略相结合的有效性的临床试验，对于NLR升高且可能对常规免疫检查点抑制剂表现出次优反应的患者可能特别有益。此外，旨在调节肿瘤免疫微环境的方法，例如结合PD-L1抑制剂和其他免疫调节剂的联合疗法，可能为改善胆道癌结局揭示新途径。
局限性
免疫微环境是动态的，初次手术时的PD-L1表达可能不能完全代表进行免疫治疗时复发期的免疫状态。这种时间差异是我们研究的一个重要局限性，并强调需要结合在复发时重复活检的纵向免疫分析的前瞻性研究。尽管所有患者均接受手术且记录了术后治疗，但分析中未包括化疗或靶向治疗的详细信息。因此，无法充分评估这些治疗对生存结局的潜在影响。需要具有全面治疗数据的未来研究以进一步阐明免疫治疗在该患者群体中的影响。由于存档材料有限，缺乏相邻非肿瘤组织的PD-L1评估，限制了对TIICs PD-L1表达升高肿瘤特异性的明确确认。
