引言
随着人类预期寿命的延长，年龄相关疾病，特别是神经退行性疾病如阿尔茨海默病（AD），已成为全球主要的致病原因。因此，亟需有效策略以促进成功老龄化，其特征是老年人维持更好的认知功能、参与社会活动且极少出现年龄相关疾病迹象。衰老与适应新刺激能力下降及相当一部分个体出现认知衰退相关。动物模型和人类尸检脑组织研究提示，与衰老相关的认知障碍通常与大脑中的多种不利变化有关，尤其在海马体中。这些年龄相关变化包括氧化应激增加、线粒体功能障碍和神经炎症衰老。神经炎症衰老是一种无菌、中度、慢性的神经炎症，在发展为神经退行性疾病的个体中显著增加。其特点是活性氧（ROS）浓度升高，与线粒体功能障碍相关，并伴随多种神经炎症信号级联的激活，包括NLR家族pyrin结构域包含蛋白3（NLRP3）炎症小体的激活，以及环状GMP-AMP合成酶（cGAS）-干扰素基因刺激因子（STING）通路触发的I型干扰素（IFN-1）信号。
先前研究表明，脑内神经干细胞（NSC）移植在脑衰老和AD模型中具有一定益处，但这些益处主要归因于旁观者效应（即其分泌组的旁分泌作用），其中包括抗炎、神经保护和神经修复活性。从这个角度看，人诱导多能干细胞（hiPSC）来源的NSCs产生的细胞外囊泡（EVs），保留了亲代细胞的大部分治疗效应，已成为开发无细胞疗法的焦点。此外，经鼻（IN）给予的hiPSC-NSC-EVs能有效靶向整个大脑中的小胶质细胞和星形胶质细胞，并已在如AD等条件下显示出可诱导有益的转录组变化。而且，这些EVs所携带的货物（miRNAs和蛋白质）先前已通过体外和体内模型验证其介导抗氧化、抗炎和神经保护作用的能力。因此，本研究使用小鼠模型，探究了在晚中年期IN给予hiPSC-NSC-EVs是否能显著减少海马中的氧化应激并抑制小胶质细胞介导的神经炎症衰老。
材料与方法
本研究使用了从hiPSC（Wisconsin International Stem Cell Bank, IMR90-4）生成的NSCs，从第11代（P11）hiPSC-NSCs中分离EVs，并对hiPSC-NSC-EVs的数量、大小和标记物进行了表征。动物研究包括年轻成年（3月龄）和晚中年（18月龄）C57BL/6小鼠。晚中年小鼠被随机分配到载体组（aged-Veh）或EVs组（aged-EVs）进行长期研究。长期研究中的动物接受两次载体或hiPSC-NSC-EVs治疗（12 × 109 EVs, ∼25 μg总蛋白），每次剂量间隔2周。最后一次剂量后一个月，所有动物进行神经行为学测试。认知评估后，动物子组被灌注以收集脑组织进行免疫组织化学研究，或处死以收集新鲜脑组织进行生化和分子生物学研究。研究人员在行为测试、免疫组织化学、免疫荧光、生化或分子生物学分析时对动物或样本的分组身份设盲。还进行了单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析，在单次IN剂量hiPSC-NSC-EVs后7天处死晚中年雄性小鼠以分离活的小胶质细胞。
结果
hiPSC-NSC-EVs的特性与生物分布
研究所用的P11 hiPSC-NSC培养物完全由NSCs组成，所有细胞均表达NSC标志物巢蛋白（Nestin）和Sox-2。通过阴离子交换和尺寸排阻色谱从这些培养物中分离的EVs平均大小为130.9 nm。这些EVs表现出特异性标记物，如四跨膜蛋白CD63、CD81和ALIX，但不含hiPSC-NSCs中存在的胞质标记物钙联接蛋白（Calnexin）。透射电子显微镜确认了EV制剂中存在双膜结合的囊泡。IN给予的PKH-26标记的hiPSC-NSC-EVs在给药后6小时检查了其在多个脑区的生物分布。分析显示，hiPSC-NSC-EVs在给药后6小时内渗透到几乎所有脑区，在所有脑区，EVs被小胶质细胞和神经元摄取。EVs也可见与星形胶质细胞和少突胶质细胞的细胞膜相互作用。
hiPSC-NSC-EVs对海马星形胶质细胞和小胶质细胞的影响
对海马中GFAP+ 星形胶质细胞形态的评估表明，与aged-Veh组相比，aged-EVs组星形胶质细胞的肥大减少。使用ImageJ对海马中GFAP+ 星形胶质细胞元件面积分数的测量证实，aged-EVs组的雄性和雌性个体GFAP+ 结构水平低于aged-Veh组的对应个体。对海马中IBA-1+ 小胶质细胞分布的分析表明，aged-EVs组的小胶质细胞密度与aged-Veh组相当，意味着EVs治疗并未改变小胶质细胞数量。然而，对海马中小胶质细胞簇（由肥大的小胶质细胞组成，指示疾病相关小胶质细胞表型）的检查显示，aged-EVs组的水平低于aged-Veh组。量化证实，aged-EVs组的雄性和雌性小鼠比aged-Veh组的对应个体具有更少的小胶质细胞簇。
hiPSC-NSC-EVs对氧化应激和线粒体功能的影响
通过测量氧化应激标志物丙二醛（MDA）和蛋白质羰基（PCs）、氧化应激主调节因子核因子E2相关因子2（NRF2）以及抗氧化剂超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT），研究了hiPSC-NSC-EVs降低氧化应激的能力。与aged-Veh组相比，aged-EVs组的雄性和雌性个体MDA和PCs浓度降低，NRF-2和SOD浓度升高。CAT浓度在雌性aged-EVs组中增加，但在雄性中未增加。研究了hiPSC-NSC-EVs增强线粒体呼吸链相关基因表达的能力。测量的基因包括与复合体I（Ndufs6 , Ndufs7 ）、复合体II（Sdha , Sdhb ）、复合体III（Cyc1 , Bcs1l ）、复合体IV（Cox7b , Cox4i2 ）和复合体V（Slc25a1 , Atp6ap1 ）活性相关的基因。与aged-Veh组相比，aged-EVs组雄性显示许多基因表达显著增加，包括Ndufs6 , Ndufs7 , Sdha , Sdhb , Cyc1 , Cox4i2 , Slc25a1 和Atp6ap1 。雌性aged-EVs组显示出相似趋势，但显著增加的基因较少。
hiPSC-NSC-EVs对NLRP3炎症小体信号通路的影响
通过三种测量方法检验了hiPSC-NSC-EVs抑制NLRP3炎症小体激活的能力：（1）量化相关基因如Nlrp3 , Pycard , Casp1 , Il1β , Il18 的表达；（2）量化呈现NLRP3-ASC复合物的小胶质细胞百分比；（3）量化参与其激活的蛋白质浓度，包括NF-κB p65、NLRP3、ASC、Cleaved Caspase-1、IL-18和IL-1β。与aged-Veh组相比，aged-EVs组雄性显示所有测量基因表达降低，其中Nlrp3 , Pycard 和Il18 显示显著下降。雌性aged-EVs组显示相似趋势，其中Nlrp3 和il18 表达显著降低。通过NLRP3、ASC和IBA-1的三重免疫荧光及Z-切片分析检查了海马小胶质细胞内NLRP3-ASC炎症小体复合物的程度。与aged-Veh组相比，aged-EVs组的雄性和雌性显示表达NLRP3-ASC炎症小体复合物的小胶质细胞百分比更低。为了证实上述发现，测量了参与NLRP3炎症小体激活的蛋白质浓度。与aged-Veh组相比，aged-EVs组雄性显示所有测量蛋白质浓度降低，其中NF-κB p65、NLRP3、ASC和IL-18显示显著下降。雌性aged-EVs组显示相似趋势，其中NLRP3、ASC、Cleaved Caspase-1、IL-18和IL-1β浓度显著降低。
hiPSC-NSC-EVs对p38/MAPK信号通路的影响
由于NLRP3炎症小体激活的终产物（IL-1β和IL-18）以及增加的氧化应激可介导下游p38/MAPK炎症信号级联的激活，测量了hiPSC-NSC-EVs降低参与p38/MAPK信号激活的蛋白质（Myd88、Ras、pMAPK和AP-1）以及p38/MAPK激活的一些终产物（TNF-α和IL-8）浓度的能力。与aged-Veh组相比，aged-EVs组的雄性和雌性显示所有测量蛋白质浓度降低，其中Myd88、Ras、pMAPK、AP-1和TNF-α在两种性别中均显示显著下降。IL-8浓度在雌性中显著降低，但在雄性中仅显示趋势。
hiPSC-NSC-EVs对cGAS-STING信号通路的影响
测量了hiPSC-NSC-EVs降低参与cGAS-STING信号激活的蛋白质（p-cGAS、p-STING、p-TBK1和p-IRF3）及其一种终产物（IFN-α）浓度的能力。与aged-Veh组相比，aged-EVs组的雄性和雌性显示所有测量蛋白质浓度降低，其中p-cGAS、p-STING和p-IRF3在两种性别中均显示显著下降。p-TBK1浓度在雌性中显著降低，但在雄性中仅显示趋势。IFN-α浓度在雄性中显著降低，但在雌性中仅显示趋势。由于IFN-α释放增加可通过JAK-STAT蛋白激活导致下游IFN-1信号激活，测量了hiPSC-NSC-EVs降低参与JAK-STAT信号（p-JAK1、p-JAK2、p-STAT1和p-STAT3）的蛋白质浓度的能力。与aged-Veh组相比，aged-EVs组的雄性和雌性显示p-JAK2和p-STAT1浓度显著降低。p-JAK1浓度在雄性中显著降低，但在雌性中仅显示下降趋势。p-STAT3浓度在雄性和雌性的aged-Veh和aged-EVs组之间无差异。此外，证实了aged-EVs组雄性和雌性海马中选定的干扰素刺激基因（ISGs）表达降低。
hiPSC-NSC-EVs对认知功能的影响
首先使用旷场试验（OFT）检查了aged-Veh和aged-EVs组动物焦虑水平的差异。在中心区域花费的时间和进入中心区域的频率比较显示，aged-Veh和aged-EVs组的雄性和雌性行为相似。因此，认知和记忆测试的结果不受aged-Veh和aged-EVs组之间焦虑水平差异的影响。接下来使用新物体识别测试（NORT）和物体位置测试（OLT）调查了识别记忆和物体位置记忆。在NORT中，具有识别记忆能力的动物更喜欢探索新物体（NO）而非熟悉物体（FO）。在OLT中，具有物体位置记忆能力的动物更喜欢探索新位置物体（OINP）而非熟悉位置物体（OIFP）。最初证实了选用于研究的雄性和雌性小鼠在hiPSC-NSC-EVs或载体干预时间点确实表现出识别和物体位置记忆损伤。这些结果来自单独的雄性和雌性小鼠队列，以避免重复行为测试对结果的混淆效应。接下来在19.5至20.5月龄（即最后一次载体/EVs治疗后1个月开始）检查了aged-Veh和aged-EVs组动物的认知和记忆功能。在NORT中，aged-Veh组的雄性和雌性小鼠未表现出偏好探索NO或FO，而aged-EVs组的雄性和雌性小鼠偏好探索NO更长时间。在OLT中，aged-Veh组的小鼠表现出偏好探索OIFP而非OINP，而aged-EVs组的小鼠表现出偏好探索OINP更长时间。因此，aged-Veh组的雄性和雌性小鼠表现出识别和物体位置记忆形成损伤。相反，aged-EVs组的雄性和雌性小鼠表现出识别和物体位置记忆能力。
miR-30e-3p和miR-181a-5p在hiPSC-NSC-EVs抑制作用中的机制研究
通过使用转染了小鼠ASC基因的RAW-ASC细胞，研究了hiPSC-NSC-EVs如何抑制尼日利亚霉素（nigericin）诱导的NLRP3激活。首先证实了从用针对miR-30e-3p-5p的antagomirs转染的hiPSC-NSCs分离的EVs中miR-30e-3p水平显著降低。用尼日利亚霉素处理的RAW-ASC细胞的培养基显示IL-1β和IL-18水平增加，然而，尼日利亚霉素治疗后添加naïve hiPSC-NSC-EVs显著减弱了IL-1β和IL-18水平。相反，添加耗尽miR-30e-3p的hiPSC-NSC-EVs（KD-EVs）并未降低IL-1β和IL-18水平。在这些培养物的细胞裂解物中测量IL-1β和IL-18观察到相似结果。通过使用RAW-Lucia ISG细胞，研究了hiPSC-NSC-EVs如何抑制2',3' cGAMP诱导的STING激活。首先证实了从用针对miR-181a-5p的antagomirs转染的hiPSC-NSCs分离的EVs中miR-181a-5p水平显著降低。用2',3' cGAMP处理的RAW-Lucia-ISG细胞的培养基显示Lucia荧光素酶活性增加，然而，2',3' cGAMP治疗后添加naïve hiPSC-NSC-EVs显著降低了Lucia荧光素酶活性。相反，添加耗尽miR-181a-5p的hiPSC-NSC-EVs（KD-EVs）并未降低Lucia荧光素酶活性。还测量了不同组RAW-Lucia-ISG细胞裂解物中的IFN-α水平。单独用2',3' cGAMP处理的RAW-Lucia-ISG细胞中IFN-α浓度显著增加，然而，用2',3' cGAMP和naïve hiPSC-NSC-EVs处理的RAW-Lucia-ISG细胞显示IFN-α浓度降低。相反，用2',3' cGAMP和耗尽miR-181a-5p的hiPSC-NSC-EVs处理的RAW-Lucia-ISG细胞未显示IFN-α降低。
hiPSC-NSC-EVs对衰老小胶质细胞转录组的影响
从scRNA-seq数据中，首先检查了t-SNE图，未显示aged-Veh和aged-EVs组之间的清晰分离。差异表达基因（DEGs）分析显示，与aged-Veh组相比，aged-EVs组中896个基因上调，2025个基因下调。aged-Veh和aged-EVs组之间DEGs（p < 0.01）的KEGG富集分析确定这些基因映射到71条通路，包括阿尔茨海默病、氧化磷酸化、Toll样受体（TLR）信号通路、MAPK信号通路、TNF信号通路、C型凝集素受体信号通路、 mechanistic target of rapamycin（mTOR）信号通路、ForkHead box（FoxO）信号通路、Notch信号通路、Ras相关蛋白1（Rap1）信号通路和泛素介导的蛋白水解。映射到这些通路的DEGs分析显示，与阿尔茨海默病相关的许多基因上调，其中大多数DEGs与线粒体功能相关。有趣的是，与氧化磷酸化相关的所有DEGs在aged-EVs组与aged-Veh组相比也显著上调，意味着EVs治疗后晚中年小鼠线粒体活性增强。此外，hiPSC-NSC-EVs治疗调节了衰老小鼠小胶质细胞中多种神经炎症通路的转录组，其中TLR信号通路、MAPK信号通路、TNF信号通路和C型凝集素受体信号通路中的许多DEGs在aged-EVs组显著下调，意味着hiPSC-NSC-EVs治疗后神经炎症信号减少。此外，长寿相关通路中的多个DEGs，包括mTOR信号通路、FoxO信号通路和Notch信号通路，在aged-EVs组小胶质细胞中显著下调。还进行了基于簇间DEGs的小胶质细胞簇提取，得到了五个不同的簇。簇1-5中DEGs的KEGG通路分析揭示了参与多种信号通路，包括那些与神经炎症相关的通路。GeneWalk分析产生了一个基于基因连接和相关GO术语比例的散点图。具有>100个基因连接和最高相关GO术语比例（1:00）的最显著基因被识别出来。
讨论
本研究结果首次证明，晚中年小鼠IN给予hiPSC-NSC-EVs可以减弱衰老大脑中小胶质细胞的促炎转录组。这种变化与氧化应激、线粒体功能障碍和神经炎症衰老的减少相关，并在接受hiPSC-NSC-EVs的老年小鼠中观察到认知和记忆功能改善。此外，hiPSC-NSC-EVs的抗炎作用与老年海马中关键信号通路（包括NLRP3、p38/MAPK、cGAS-STING、JAK-STAT和IFN-1）激活减少相关。增加的氧化应激是脑衰老的一个关键改变，其特征是ROS水平升高，导致线粒体功能障碍和神经元突触损伤。这些变化有助于认知障碍和神经退行性疾病如AD的进展。本研究显示，hiPSC-NSC-EVs治疗有效减少了晚中年雄性和雌性小鼠老年海马的氧化应激。年龄相关神经炎症或神经炎症衰老是脑衰老的一个重要方面。关键的神经炎症通路，特别是NLRP3炎症小体，在此背景下被激活。hiPS C - N S C
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