3.1 EVs Derived From Pulmonary Endothelium Are Inversely Related With BALF and BLN Treg Proportion in ALI Mice
为了表征急性呼吸窘迫综合征（ARDS）或急性肺损伤（ALI）过程中肺内细胞外囊泡（EVs）的变化，研究人员采用近距离条形码 assay（PBA）对脂多糖（LPS）气管内注射诱导的ALI小鼠和对照小鼠的支气管肺泡灌洗液（BALF）中的单EV进行了分析。通过无监督机器学习算法FlowSOM，将EVs分为15个主要簇。其中，高表达PECAM1/CD31（内皮细胞标志物）的簇1（内皮来源EVs）在LPS-IT小鼠BALF中的比例显著升高。进一步的EV捕获磁珠流式细胞术分析证实，随着肺损伤严重程度的增加，BALF中CD31+EVs的比例也相应增加。
与此同时，研究人员发现，随着ALI严重程度的加剧，BALF和支气管淋巴结（BLNs）中CD4+T细胞内的调节性T细胞（Tregs）比例显著下降。双变量分析显示，BALF中CD31+EVs的比例与BALF及BLNs中的Treg比例呈负相关。通过体内追踪实验，研究人员证实了静脉注射的GFP标记的LPS激活肺内皮细胞来源的EVs（LPS-EC-EVs）能够归巢至脾脏和BLNs，并与CD4+T细胞共定位，提示LPS-EC-EVs可能通过与Tregs相互作用影响其功能。
3.2 LPS-EC-EVs Specifically Restrain Treg Differentiation
为了阐明LPS-EC-EVs对Treg生成的影响，研究人员在体内外进行了功能验证。体内实验表明，与预注射PBS或正常肺内皮细胞EVs（EC-EVs）的小鼠相比，预注射LPS-EC-EVs的ALI小鼠肺损伤更严重，且BALF和BLNs中的Treg比例显著降低。
体外实验中，研究人员将脾脏来源的初始CD4+T细胞在Treg极化条件下与EC-EVs或LPS-EC-EVs共培养5天。扫描电镜观察证实了EVs与细胞的相互作用。研究发现，LPS-EC-EVs（而非EC-EVs）显著抑制了Treg的极化效率，表现为Foxp3+细胞比例下降，同时上清液中TGF-β1和KGF的浓度降低，Treg特征基因（如Foxp3, Il2ra, Ctla4）的表达下调。值得注意的是，LPS-EC-EVs对Th2和Th17分化无显著影响，仅轻微影响Th1分化。通过谱系追踪实验，研究人员进一步证实LPS-EC-EVs能够诱导Treg失稳，增加exTregs（YFP−tdTomato+）的比例。一系列对照实验排除了LPS残留污染对Treg抑制效应的干扰。
3.3 TGF-β and IL-2 Signalling Pathways Are Intact in EV-Primed Tregs
Treg的生成和扩增依赖于T细胞受体（TCR）信号、转化生长因子-β（TGF-β）信号和白细胞介素-2（IL-2）信号。为了探究LPS-EC-EVs是否通过干扰这些关键信号通路来抑制Treg，研究人员检测了相关分子的表达和磷酸化水平。结果显示，LPS-EC-EVs处理并未影响Tregs表面TGF-β RI、TGF-β RII、IL-2R和CD69的表达，也未抑制smad2、smad3和STAT5的磷酸化。这些结果表明，LPS-EC-EVs对Treg的抑制作用并非通过干扰TGF-β、IL-2或TCR信号通路实现。
3.4 Tregs Primed With LPS-EC-EVs Produce Massive IL-21
为了深入探究其分子机制，研究人员对经EC-EVs或LPS-EC-EVs处理的Tregs进行了全转录组测序分析。结果显示，与EC-EVs组相比，LPS-EC-EVs组有709个基因显著上调，209个基因下调。其中，Il21基因的表达上调超过1000倍，而Treg特征基因Foxp3等的表达下调。生物信息学 ingenuity pathway analysis（IPA）分析表明，上调基因富集于STAT3等信号通路，而IL-21中心分子网络分析提示IL-21参与了"T辅助细胞分化"和"STAT3通路"等过程。
通过RT-qPCR、ELISA和细胞内染色，研究人员在mRNA和蛋白水平证实了LPS-EC-EVs能够显著诱导Tregs产生IL-21。共聚焦显微镜分析显示，在LPS-EC-EVs暴露后，Tregs内Foxp3与IL-21存在共定位。进一步的研究发现，IL-21通过诱导STAT3持续磷酸化并核转位，进而抑制Foxp3的转录，这与之前的报道一致。
3.5 Inhibition of IL-21 Signalling Reverses EV-Induced Treg Restriction
鉴于IL-21信号通路在LPS-EC-EVs抑制Treg中的关键作用，研究人员评估了阻断该通路的效果。体内生存实验表明，Il21−/−小鼠在致死剂量LPS攻击下存活率高于野生型（WT）小鼠，肺组织修复更快。
体外实验中，使用IL-21中和单抗（aIL21）、IL-21受体中和单抗（aIL21R）或STAT3特异性抑制剂Stattic，均能以剂量依赖的方式逆转LPS-EC-EVs对Treg极化的抑制，并降低STAT3的磷酸化水平，恢复Foxp3表达。从Il21−/−小鼠分离的初始CD4+T细胞在LPS-EC-EVs存在下极化形成Tregs时，其抑制效应显著弱于WT来源的Tregs。
为了验证T细胞内在的IL-21效应，研究人员构建了嵌合体小鼠模型。结果显示，与WT嵌合体小鼠相比，Il21−/−嵌合体小鼠在LPS-EC-EVs预刺激和LPS攻击后，BALF和BLNs中的Treg比例更高，肺组织损伤更轻，中性粒细胞浸润（MPO, Ly6G, NE表达）也更少。这些结果充分证明了LPS-EC-EVs通过T细胞内在的IL-21信号环路抑制Treg分化。
3.6 Med1 Enriched in LPS-EC-EVs Serves as an IL-21 Transcriptional Regulator
接下来，研究人员探究了LPS-EC-EVs中何种成分介导了上述效应。通过Triton X-100和蛋白酶K处理去除LPS-EC-EVs中的蛋白质后，其抑制Treg极化的能力丧失，提示EV蛋白质在其中起关键作用。质谱蛋白质组学分析发现，与EC-EVs相比，LPS-EC-EVs中有136种蛋白质特异性富集，但其中不包含IL-21，排除了EVs直接递送IL-21的可能性。
通过结合转录因子（TF）预测数据库（GTRD和AnimalTFBD）分析，研究人员发现Med1是唯一一个在LPS-EC-EVs中富集且被预测为IL-21潜在调控因子的蛋白质。Western blot、Ponceau S染色和免疫电镜（IEM）结果均证实Med1在LPS-EC-EVs中特异性富集。通过GFP标记追踪和Flag-Med1过表达EVs共培养实验，研究人员证实LPS-EC-EVs中的Med1能够进入Tregs细胞核。
为了验证Med1是否直接调控IL-21的转录，研究人员进行了Flag标签染色质免疫共沉淀（ChIP）-qPCR和双荧光素酶报告基因实验。结果显示，EVs来源的Flag-Med1能够结合到IL-21基因启动子区的预测位点，并显著增强IL-21启动子的转录活性，而位点突变则废除了此效应。这表明LPS-EC-EVs中富集的Med1是IL-21的一个激活转录因子。
3.7 Med1 in LPS-EC-EVs Is the Key Molecule That Suppress Tregs
为了确认Med1在LPS-EC-EVs抑制Treg中的关键作用，研究人员构建了Med1敲低（KD）的肺内皮细胞系。与LPS-EC-EVs相比，Med1-KD LPS-EC-EVs对Treg极化的抑制效应显著减弱，对IL-21表达的诱导作用也明显降低。
在体实验中，研究人员通过静脉注射靶向肺内皮的shMed1伪型腺相关病毒（shMed1-AAV-LungX），特异性降低肺内皮细胞中Med1的表达。结果显示，与对照组（shNC-AAV-LungX）相比，shMed1-AAV-LungX处理的ALI小鼠生存率提高，其BALF-EVs中Med1水平显著降低，BALF和BLNs中的Treg比例更高，肺组织损伤和中性粒细胞浸润也显著减轻。这些结果证实了肺内皮来源的携带Med1的EVs在ALI/ARDS中抑制Treg诱导的关键致病作用。
3.8 Med1 is Accumulated in BALF-EVs in Patients With ARDS
最后，研究人员在一项临床队列研究中进行了验证。他们收集了9例ARDS患者和5例机械通气的非ARDS对照患者的BALF样本。结果显示，与对照组相比，ARDS患者BALF中CD31+EVs的比例显著升高，BALF-EVs中Med1的富集程度（以CD9为内参标准化后）以及BALF中IL-21的浓度也显著更高。相关性分析表明，BALF-EVs中Med1的相对表达量与CD31+EVs比例和BALF中IL-21浓度均呈显著正相关。这提示Med1在BALF-EVs中的表达可能成为ARDS的潜在生物标志物。
4 Discussion
本研究系统阐述了在ARDS中，激活的肺内皮细胞来源的EVs通过递送转录辅激活因子Med1，诱导Tregs产生IL-21，进而通过激活STAT3信号通路抑制Foxp3表达，破坏Treg稳定性，从而加剧肺损伤的新的细胞间通讯机制。该发现不仅深化了对ARDS免疫病理机制的理解，也为靶向EVs或其 cargoes（如Med1）或IL-21信号通路治疗ARDS提供了新的思路和潜在靶点。研究同时指出了当前研究的局限性，包括动物模型的局限性、EVs来源定义的潜在混杂、其他EV亚群的可能作用以及体外培养EVs与体内环境的差异等。
