ABSTRACT
细胞外囊泡（EV）正通过其生物活性货物成为代谢稳态的新兴调节因子。本研究首先研究了来自脂联素敲除（KO）小鼠的血浆EV的脂质组学谱和功能效应，以识别与代谢功能障碍相关的EV相关脂质特征。脂质组学分析显示，与野生型（WT）EV相比，KO EV富含鞘脂（SL）和多不饱和磷脂（PL）。为了评估功能后果，使用巨噬细胞、骨骼肌细胞和胰腺β细胞进行了受体细胞实验。KO EV在RAW 264.7巨噬细胞中的摄取增加，并诱导了升高的活性氧（ROS）以及NF-κB和IRF炎症通路的激活。在L6骨骼肌细胞中，WT EV增加了ATP产量，而KO EV未能引发这种效应。此外，KO EV损害了INS-1胰腺β细胞中葡萄糖刺激的胰岛素分泌（GSIS）。这些发现表明，KO小鼠EV中改变的脂质组成有助于受体细胞中的氧化应激、炎症和受损的代谢调节。接下来，通过记录代谢综合征（MetS）患者的血浆EV表现出与小鼠KO表型平行的脂质组学重塑特征，特别是富含含PUFA的脂质，建立了转化相关性。总之，这些发现确定了一条保守的脂联素-EV脂质组成轴，调控氧化应激、炎症和受损的代谢调节。本研究提出的新知识对代谢疾病中的生物标志物发现和治疗靶向具有意义。
1 引言
细胞外囊泡（EV）越来越被认为是代谢疾病的贡献者，其数量与身体质量指数（BMI）、血压和胰岛素抵抗等参数相关。在其多样的货物中，脂质和调节脂质代谢的蛋白质正在成为EV功能的关键介质和代谢状态的生物标志物。
脂质组学分析表明，EV脂质谱反映了其来源的代谢状况。例如，来自肥胖个体脂肪组织的EV表现出肥胖相关的脂质指纹，而前列腺癌患者的尿液EV呈现独特的脂质组学特征。除了作为生物标志物，EV脂质主动影响疾病病理生理学。巨噬细胞来源的EV，富含花生四烯酸前体和酶，通过促进癌症信号传导和抗肿瘤免疫反应来调节肿瘤微环境。此外，来自修复相关巨噬细胞的富含胆固醇的EV已被证明可以增强少突胶质细胞的髓鞘再生。类似地，暴露于TNF诱导的炎症的脂肪细胞来源的EV显示出改变的脂质谱，富含多不饱和脂肪酸（PUFA）磷脂和鞘脂，并且可以通过增强脂肪酸氧化来驱动黑色素瘤细胞中的代谢重塑。尽管有这些进展，但EV脂质在代谢疾病中的作用及其下游影响仍未完全了解。
脂联素，一种主要由脂肪细胞分泌的脂肪因子，在调节脂质代谢、胰岛素敏感性和炎症中起着核心作用，其循环水平与代谢疾病严重程度呈负相关。尽管脂联素已在循环EV中检测到并被证明介导器官间通讯，但脂联素如何影响EV脂质组成以及这种效应是否反映在代谢疾病状态中仍不清楚。
本研究旨在研究脂联素缺乏如何重塑血浆来源的EV的脂质组成并改变其对代谢受体细胞（包括巨噬细胞、骨骼肌和胰腺β细胞）的影响。我们进一步整合了人类代谢综合征（MetS）EV脂质组学，以识别将脂联素状态与代谢健康联系起来的保守脂质特征。
2 材料与方法
2.1 动物模型
研究使用内部培育的脂联素敲除（KO）小鼠和野生型同窝小鼠。
2.2 细胞培养
使用了L6大鼠成肌细胞、RAW 264.7小鼠巨噬细胞、RAW-Dual报告细胞和INS-1胰腺β细胞。所有EV处理实验均使用经超速离心去除EV的胎牛血清（FBS）制备培养基。
2.3 代谢综合征队列样本
血浆样本来自女性参与者，分为对照组（CON）和代谢综合征（MetS）组，每组n=8。临床和生化数据详见表1。根据既定指南进行临床分类。
2.4 细胞外囊泡（EV）分离
使用尺寸排阻色谱法（SEC）从血浆样本中分离EV。
2.5 血浆脂联素水平测量
使用小鼠或人脂联素ELISA试剂盒测量血浆脂联素水平。
2.6 蛋白质印迹
使用SDS-PAGE和PVDF膜转移技术分析EV蛋白标志物。
2.7 冷冻电镜样本制备和成像
使用冷冻电子显微镜（cryo-EM）观察EV形态。
2.8 纳米颗粒跟踪分析（NTA）
使用NanoSight 3000测量分离的EV样本中的颗粒数量和尺寸分布。
2.9 脂质组学分析
使用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）与多反应监测（MRM）进行靶向脂质组学分析。使用含内标（EquiSPLASH）的提取溶剂（丁醇:甲醇=1:1, v/v）提取脂质。数据通过MassHunter软件处理，脂质浓度使用已知量的内标转换为绝对浓度（nM）。
2.10 EV在受体细胞中的摄取
使用DiR染料标记EV，通过流式细胞术和共聚焦显微镜评估EV在RAW 264.7巨噬细胞、L6细胞和INS-1细胞中的摄取。
2.11 氧化应激评估
使用BODIPY C-11评估脂质过氧化，使用CellROX深红探针评估细胞氧化应激，使用MitoSOX Red评估线粒体氧化应激（超氧化物）。
2.12 RAW-Dual报告细胞实验
使用RAW-dual报告细胞评估NF-κB和IRF3依赖性通路的激活。
2.13 定量PCR（qPCR）
使用Trizol法提取RNA，通过qPCR分析基因表达。
2.14 ATP测量
使用ATP检测试剂盒在L6细胞中测量细胞内ATP水平。
2.15 线粒体网络测量
使用MitoTracker Green染色L6细胞，通过共聚焦显微镜成像，并使用MiNA工具集和IMARIS软件分析线粒体长度、网络连接性和密度。
2.16 葡萄糖刺激的胰岛素分泌（GSIS） assay
在INS-1 832/3细胞中，用EV处理不同时间后，在低葡萄糖（2.0 mM LG）和高葡萄糖（16.7 mM HG）的KRB缓冲液中孵育1小时，收集上清液使用HTRF超灵敏胰岛素检测试剂盒量化胰岛素分泌。
2.17 Seahorse代谢通量分析
在L6肌管中使用Seahorse XF细胞线粒体压力测试试剂盒测量线粒体呼吸和实时代谢通量。
2.18 统计学
使用GraphPad Prism 9.0软件进行统计分析。数据以均值±标准差（SD）表示，线图以均值±标准误（SEM）表示。使用Student t检验、单因素或双因素方差分析（ANOVA）进行组间比较。显著性水平设定为*p < 0.05, p < 0.01,*p < 0.001。
3 结果
3.1 脂联素KO小鼠在白脂肪组织和股四头肌中表现出改变的脂质代谢相关基因表达
在检查脂联素缺乏对血浆EV脂质组成及其在受体细胞中的功能后果之前，研究人员首先验证了KO小鼠模型的基因型。ELISA证实KO小鼠循环中缺乏脂联素。为了在EV分析之前验证脂联素KO模型中的代谢改变，研究人员评估了关键代谢器官（包括腹股沟和附睾白色脂肪组织（iWAT和eWAT）、股四头肌和肝脏）中脂质代谢相关基因的表达。尽管基因型之间组织重量相对于体重的没有显著差异，但脂质代谢相关基因的表达——特别是涉及磷脂（PL）（例如Ptdss1/2, Cept1, Lpcat1-3, Chpt1）、鞘脂（SL）（例如Sgms1, Cert1, Spmd1, AdipoR1/2）和脂肪酸组成重塑（例如Acsl1, Acsl4, Scd1, Fads1/2）的基因——在iWAT、eWAT以及股四头肌中显著改变。这些发现强调了脂联素缺乏改变了骨骼肌和脂肪组织中的脂质代谢。
3.2 来自脂联素缺陷小鼠的血浆EV表现出增加的颗粒数量和尺寸
使用尺寸排阻色谱法（SEC）分离血浆EV，并根据国际细胞外囊泡学会（ISEV）指南对其形态、数量、大小和EV特异性标志物表达进行表征。蛋白质印迹分析证实了经典EV标志物（包括CD63、Flotillin-1和Alix）的存在，以及非EV污染物的缺失。KO小鼠EV中缺乏脂联素蛋白进一步验证了敲除效率。冷冻电子显微镜（Cryo-EM）显示了完整的囊泡形态。纳米颗粒跟踪分析（NTA）显示，与WT对照组相比，KO小鼠血浆中的颗粒浓度显著增加，中位和平均颗粒尺寸更大（平均尺寸：WT, 95.9 ± 2.3 nm; KO, 120.0 ± 8.0 nm, n = 5, p = 0.0019）。这些发现表明，脂联素缺乏改变了循环血浆EV的物理特性。
3.3 KO小鼠的EV富含磷脂和鞘脂
使用LC-MS/MS与多反应监测（MRM）分析对血浆来源的EV进行脂质组学分析。每个样品使用等量的EV蛋白（100 µg），脂质丰度针对类别特异性内标进行归一化。主成分分析（PCA）清楚地将WT和KO小鼠的EV脂质组分开，显示WT组内变异性较小。KO EV显示出显著更高的总脂质含量，这主要由PL、SL和甾醇脂质驱动。虽然每组内的总体脂质类别比例仅显示适度变化，但几个PL亚类在KO EV中显著升高，包括磷脂酰丝氨酸（PS）、磷脂酸（PA）、磷脂酰胆碱（PC）、磷脂酰乙醇胺（PE）、磷脂酰肌醇（PI）、PE缩醛磷脂（P）、PC醚脂（O）和磷脂酰甘油（PG）。此外，胆固醇（COH）、胆固醇酯（CE）、鞘磷脂（SM）和1-磷酸鞘氨醇（S1P）在KO EV中显著增加。相反，胆汁酸（胆酸和脱氧胆酸）和磷酸肌醇（PIP）在WT EV中相对更丰富，尽管这些差异未达到统计学显著性。
这些组成变化表明，脂联素缺乏不仅定量地改变了EV脂质组成，而且定性也改变了，影响了对于膜完整性、信号传导和生物活性脂质生物合成至关重要的脂质。脂肪酸尾部组成的变化可能进一步导致EV功能的改变。热图和火山图分析突出了KO和WT EV之间不同的脂质特征，其中PS(38:4)、PE(38:5)(a/b)、SM(44:3)和S1P(d18:0)在KO EV中富集，而Cer(m18:1/18:0)、PE(P-18:1/20:5)(a/b)和LPC(15:0)(a/b)在WT EV中富集。
KEGG通路富集分析确定了KO EV中甘油磷脂代谢、醚脂代谢和鞘脂通路的显著上调。BioPAN脂质网络分析证实了这些发现，表明在PL类别中向PS、PE和PC的生物合成活性增加，以及在SL类别中向SM的生物合成活性增加。总之，这些结果表明，脂联素缺乏促进了EV脂质重塑，特别是增强了PL和SL的丰度。
为了评估这些EV脂质改变是否反映了组织水平的重塑，研究人员将EV脂质组与代谢器官中的脂质代谢相关基因表达谱进行了比较。如图S2所示，来自KO小鼠的iWAT显示参与PL生物合成和重塑（Ptdss1, Ptdss2, Pisd, Pla2g2a, Lpcat1–3, 和 Chpt1）以及SL代谢（Sgms1, Cert1, 和 Smpd1）的基因显著上调。这些发现，连同基因型依赖的转录变化，支持了脂肪组织脂质代谢与循环EV脂质组成之间的协调重塑轴。
3.4 不饱和脂肪酸含有的脂质种类在KO小鼠的EV中富集
脂肪酸尾部组成的分析显示，KO EV中单不饱和脂肪酸（MUFA）和多不饱和脂肪酸（PUFA）含有的脂质显著富集。特别是，大多数PL类别，包括PC、PE和PS，在KO EV中显示出与WT对照组相比，PUFA含有的种类占主导地位。相反，虽然SM和S1P水平在KO EV中也显著升高，但这些SL种类包含饱和脂肪酸（SFA）、MUFA和PUFA含有的形式的混合物，表明它们的富集并不限于不饱和酰基链。这种模式表明在缺乏脂联素的情况下，PL和SL之间脂肪酸掺入的机制不同。
鉴于富含PUFA的PL和S1P都与氧化应激和炎症信号传导有关，KO EV改变的脂质组成可能构成相对于WT EV的独特生物活性基础。
3.5 RAW 264.7巨噬细胞对KO来源的EV摄取增强
巨噬细胞是循环EV的关键靶细胞，在炎症和免疫调节中起核心作用。为了评估具有改变脂质组成的EV是否表现出差异性的细胞摄取，将来自WT和KO小鼠的血浆来源的EV用DiR标记，并与RAW 264.7巨噬细胞孵育6或18小时。共聚焦显微镜证实了DiR标记的EV的内化，定位于质膜附近或内部；受体细胞膜被预染色以便于观察。流式细胞术分析进一步量化了EV摄取，显示在两个时间点，KO EV导致DiR阳性细胞的比例相对于WT EV增加了约两倍。这些结果表明，EV脂质组成的差异——特别是PL、SL和不饱和脂肪酸链的富集——可能增强了细胞摄取效率。
3.6 来自KO小鼠的EV在RAW 264.7巨噬细胞中诱导轻度氧化应激和促炎反应
为了评估EV暴露的下游效应，研究人员测量了RAW 264.7细胞中的脂质过氧化、ROS产生和炎症反应。与WT EV相比，KO EV在处理24小时后诱导了轻度但统计学上显著的脂质过氧化和ROS水平增加。qPCR分析显示，抗氧化酶（SOD1, SOD2, 和 GPX4）或ROS生成酶（NOX1, NOX2）的表达在治疗组之间没有显著差异，表明观察到的氧化应激可能源于EV货物含量而非转录调控。为了进一步评估炎症信号传导，研究人员采用了表达分泌型胚胎碱性磷酸酶（SEAP）和Lucia荧光素酶的双报告RAW 264.7巨噬细胞。用KO EV处理激活了NF-κB和IRF通路，表现为培养基中SEAP和荧光素酶活性升高。一致地，KO EV处理上调了促炎细胞因子的mRNA表达，包括IL-1β、IL-6和TNF-α（NF-κB通路），以及IFN-α/β（IRF通路）。总之，这些发现表明，KO EV在巨噬细胞中引发氧化应激并激活促炎信号级联。
3.7 来自KO小鼠的EV在L6细胞中诱导氧化应激并降低ATP产量
为了评估相关骨骼肌模型中的氧化应激和线粒体反应，研究人员使用了L6细胞，这是一个广泛用于研究线粒体形态和能量产生的系统。尽管在RAW 264.7细胞中反应更明显，但L6细胞也表现出对KO EV的摄取增加 compared with WT EV。处理24小时后，相对于WT EV，KO EV显著增加了脂质过氧化、总细胞内ROS和线粒体ROS水平。
WT EV处理增强了细胞内ATP水平，而KO EV处理的细胞显示出适度但相对较低的水平。相应地，线粒体形态分析显示，在KO EV暴露后，分支长度变短，网络复杂性降低。3D重建证实了伸长线粒体的损失。补充的代谢通量分析显示，在KO EV处理的细胞中，线粒体储备能力和偶联效率有降低的趋势，与氧化灵活性受损一致。
总之，这些发现表明，KO EV在L6细胞中诱导氧化应激并适度损害线粒体结构和生物能量效率。
3.8 来自KO小鼠的EV降低了INS-1细胞中葡萄糖刺激的胰岛素分泌（GSIS）
与其在L6细胞中的效应类似，KO EV在INS-1胰腺β细胞中也引发了不良反应。在EV处理4、24和48小时后测量了GSIS。在4和24小时，KO EV处理的细胞在高葡萄糖（16.7 mM）刺激下显示出胰岛素分泌减少的非显著趋势。到48小时，GSIS反应显著减弱，表明长时间暴露于KO EV会损害β细胞葡萄糖反应性和胰岛素分泌功能。
总之，这些发现表明，来自脂联素缺陷小鼠的EV在多种细胞类型（包括骨骼肌和胰腺β细胞）中诱导氧化应激并损害关键的代谢功能，反映了EV脂质重塑的系统性影响。
3.9 来自代谢综合征（MetS）患者的EV表现出降低的EV相关脂联素水平
为了确定在小鼠中观察到的脂联素缺陷EV表型是否在人类中保守，研究人员分析了来自MetS患者和健康对照（CON）的血浆EV。临床指标，包括BMI和HOMA-IR，总结在表1中。
MetS患者的血浆脂联素水平显著低于CON。NTA显示，MetS组中EV颗粒计数有非显著升高的趋势，中位EV尺寸适度减小。蛋白质印迹进一步证实了MetS患者中EV相关脂联素丰度降低。
总之，这些数据表明，MetS与系统和囊泡脂联素缺乏相关，提示在代谢压力下EV生物发生和/或货物装载发生了改变。这一发现提供了与在小鼠中观察到的脂联素缺陷EV表型直接对应的临床对应物。
3.10 来自MetS患者的EV显示出改变的脂质组成
通过偏最小二乘判别分析（PLS-DA）进行的脂质组学分析表明，CON和MetS EV之间存在清晰的分离。总脂质含量相当，但类别水平的组成显著不同：MetS EV显示出升高的PL和甘油脂部分，特别是PG、PE和PC，以及TG和醚连接TG种类的显著富集，对应于比CON EV高12.97%的甘油脂比例。相反，溶血磷脂（LPC和LPE）在CON EV中相对富集，如差异丰富种类热图所示。
这些数据揭示了MetS来源的EV中存在明显的脂质组学重塑，其特征是PL和中性脂类别的扩展。
3.11 脂联素连接的EV脂质重塑的转化和临床相关性
基于人类脂质组学谱，研究人员接下来检查了MetS EV中的组成变化是否与在脂联素缺陷小鼠中观察到的变化平行，以及这些改变是否与临床代谢指标相关。匹配脂质种类的散点比较揭示了小鼠KO和人类MetS数据集之间的方向一致性。在KO和MetS EV中均增加的脂质（象限1；Q1）主要是含PUFA的PL（例如PC 38:4, PE 40:6, PG 36:2）和TG种类（TG52:2, TG54:3）。在两者中均减少的种类（象限3；Q3）包括LPC（LPC 18:0, LPE 18:1）和短链SM。大多数FDR显著的种类聚集在这些象限内，表明在低脂联素或代谢压力条件下，不饱和PL种类的共享富集。跨象限的脂质组成分析进一步揭示了代表疾病方向性变化的象限（Q1, Q2, 和 Q4）中PUFA部分的持续富集。TG比例仅在人类MetS驱动的象限中增加，并且不是KO臂的定义特征，表明PUFA富集代表了一个保守的跨物种特征，而TG负载是背景特异性的。
偏相关分析（针对年龄和BMI进行调整）揭示了EV脂质特征与关键代谢指标之间的显著关联。中性和胆固醇相关脂质（TG, DG, DE, COH, AC）显示与HOMA-IR和HbA1c呈正相关，而PL亚类（LPC, LPE, PE, PG, PI, PA）呈负相关，表明在胰岛素抵抗
