1 引言
靶向蛋白降解（TPD）技术，尤其是蛋白降解靶向嵌合体（PROTAC），已成为一种革命性的治疗模式。然而，传统PROTACs的临床应用面临两大挑战：其一，其发展严重依赖有限的E3连接酶（如CRBN和VHL），这限制了可降解蛋白的范围，并可能通过E3连接酶突变或下调导致获得性耐药；其二，作为全身给药的小分子，传统PROTACs缺乏时空控制，可能导致显著的全身毒性，因为目标蛋白在健康组织和肿瘤中均被降解。因此，迫切需要开发能够绕过特定E3连接酶依赖并提供精确、可控降解的新型TPD策略。
光疗技术，包括光动力疗法（PDT）和光热疗法（PTT），以其卓越的时空精度而闻名。治疗效果仅限于激光照射的区域和时间，具有最小的全身毒性。利用这种高精度控制进行蛋白降解成为一个极具吸引力的策略。目前，该领域的大部分研究集中在PDT介导的蛋白降解上，而光热介导的蛋白降解探索仍处于起步阶段。硫化铜（CuS）纳米颗粒因其高光热转换效率（PCE）、优异的生物相容性以及在第二近红外（NIR-II）窗口（1000-1700 nm）的强吸收和稳定性而受到广泛关注。NIR-II光在体内应用中具有更优的组织穿透深度和更高的最大允许曝光量。因此，开发一种基于CuS、NIR-II激活、可精确靶向肿瘤的PTT降解系统具有深远的治疗潜力。
本研究选择含溴结构域蛋白4（BRD4）作为治疗靶点。BRD4作为一种关键的表观遗传阅读器，通过驱动关键癌基因（如MYC）的转录，在肿瘤发生中发挥核心作用。此外，新出现的证据表明BRD4通过调节免疫检查点配体PD-L1参与免疫逃逸。这种双重作用使BRD4成为一个极具价值的靶点。为实现高度可控、肿瘤特异性的BRD4降解，设计并构建了多功能光热靶向降解（PTTAC）纳米平台PCN-CuS-JQ/RGD。该系统利用铁卟啉金属有机框架（PCN(Fe)）作为响应性载体，同时赋予其磁共振成像（MRI）能力以进行体内追踪。该平台功能化了CuS（NIR-II光热剂）、JQ1（BRD4配体）和RGD（肿瘤靶向肽）。这种设计促进了级联递送序列：RGD肽首先引导纳米平台到达肿瘤细胞，内化后，PCN(Fe)载体响应性分解，随后释放更小的CuS-JQ/RGD单元，这些单元能够进入细胞核并与BRD4结合。这一级联过程实现了靶点的高度局部积累，为NIR-II光触发的光热降解奠定了基础。除了直接抑制肿瘤，本研究还揭示了PTTAC介导的BRD4降解能有效重塑肿瘤免疫微环境，特别是通过触发免疫原性细胞死亡（ICD）和抑制PD-L1表达。这种有效的免疫调节作用与抗PD-L1（aPD-L1）检查点封锁产生强大协同效应，在双侧肿瘤模型中显著放大治疗反应，为联合癌症免疫治疗提供了有力策略。
2 结果与讨论
2.1 PCN-CuS-JQ/RGD的制备与表征
PCN-CuS-JQ/RGD多功能纳米平台的合成路径如示意图1A所示。首先，制备了具有末端硫醇基团的功能配体：BRD4抑制剂（JQ-2C-SH）和肿瘤靶向肽（C-PEG-RGD）。JQ-2C-SH衍生物通过三步化学反应合成，每步产物均通过1 H-NMR、13 C-NMR和高分辨质谱（HRMS）进行结构验证。C-PEG-RGD通过标准固相肽合成法合成，并通过高效液相色谱（HPLC）和HRMS确认。随后，分别在高温条件下合成PCN(Fe)和CuS纳米颗粒。然后通过静电吸附将CuS纳米颗粒整合到PCN(Fe)载体上。最后，在水和甲醇的混合溶剂中，BRD4抑制剂和RGD肽通过其末端硫醇基团配位并负载到CuS纳米颗粒上。
透射电子显微镜（TEM）和扫描电子显微镜（SEM）图像显示，PCN(Fe)载体在吸附CuS后具有明显的颗粒状表面。PCN-CuS-JQ/RGD的紫外-可见光谱在1064 nm处显示吸收，表明CuS纳米颗粒的成功吸附。由于CuS纳米颗粒带有负表面电荷，它们的吸附导致整个纳米系统的Zeta电位更负。与PCN-CuS相比，PCN-CuS-JQ/RGD的傅里叶变换红外光谱显示亚甲基基团的不对称和对称伸缩振动吸收带以及酰胺N-H弯曲振动吸收带显著增加，这些峰与C-PEG-RGD的特征信号匹配，证实了PEG修饰的肿瘤靶向肽的成功负载。紫外-可见光谱显示PCN-CuS-JQ/RGD中存在JQ-2C-SH的特征吸收峰。此外，X射线光电子能谱分析和元素 mapping检测到氯元素的存在，这是JQ-2C-SH特有的元素，共同证实了JQ-2C-SH的成功负载。在XRD图谱中，48°附近的峰对应于CuS的衍射峰，进一步验证了CuS纳米颗粒的成功吸附。动态光散射测量显示PCN-CuS-JQ/RGD系统的流体动力学尺寸约为280 nm，多分散指数为0.13，证实其具有良好的均匀分散性。溶血实验表明，即使在高浓度100 µg/mL下，PCN-CuS-JQ/RGD的溶血率仍低于5%，证实了纳米系统的高血液相容性，支持其安全的体内应用潜力。
2.2 光热性能与刺激响应行为
随后评估了PCN-CuS-JQ/RGD的光热性能。在不同浓度和功率密度下研究了纳米系统在1064 nm激光照射下的温度随时间变化。值得注意的是，当PCN-CuS-JQ/RGD溶液在功率密度1.02 W/cm2 下照射时，温度在5分钟内达到约45°C，这也通过热成像可视化。达到45°C证实纳米系统可以达到这一治疗阈值。这种局部高温不仅足以诱导肿瘤细胞死亡，而且已知会导致蛋白展开、变性和聚集，这为本研究探讨的光热介导的蛋白降解提供了精确机制。为了验证其光热稳定性，对PCN-CuS-JQ/RGD溶液进行了五次重复加热-冷却循环。纳米平台保持了稳定的光热转换能力，没有显著衰减，表明其在PTT应用中具有优异的热稳定性。PCN-CuS-JQ/RGD的光热转换效率计算为24.14%，证实了其作为NIR-II光热剂的高效率。
该设计的一个关键特征是"逐步"递送，这要求PCN(Fe)载体在进入肿瘤细胞后分解，释放更小的功能性CuS-JQ/RGD单元。假设这种分解是由肿瘤微环境（TME）中高浓度的谷胱甘肽（GSH）触发的。为了验证这一点，将PCN-CuS-JQ/RGD在纯水或模拟TME的5 mM GSH溶液中孵育48小时。TEM图像表明，在纯水中，纳米平台保持完整，保留其大的PCN(Fe)框架结构。相反，在5 mM GSH中孵育后，PCN(Fe)框架显示出明显的结构坍塌和分解迹象。这种GSH触发的纳米系统从大纳米载体向其更小组分纳米颗粒的转变是一个关键的设计特征。这种尺寸减小对于组分通过核孔转位、靶向位于细胞核的BRD4蛋白以及实现后续的光热降解至关重要。此外，PCN(Fe)框架内的顺磁性三价铁离子赋予PCN-CuS-JQ/RGD纳米平台T1 加权磁共振成像能力。体外实验证明了在T1 加权MRI扫描上信号强度呈浓度依赖性增加，证实了其在MRI引导抗肿瘤治疗中的潜力。
2.3 PTTAC策略的体外抗肿瘤效果
在评估治疗效果之前，验证了纳米平台的细胞摄取。用罗丹明B标记的PCN-CuS或PCN-CuS-JQ/RGD孵育小鼠乳腺癌细胞（4T1）的共聚焦激光扫描显微镜图像显示了明显的时间和浓度依赖性摄取模式。值得注意的是，PCN-CuS-JQ/RGD组表现出比未修饰的PCN-CuS显著增强的细胞内化，这可能归因于RGD介导的靶向。随后，使用细胞计数试剂盒-8评估了PCN-CuS-JQ/RGD和PCN-CuS-RGD对4T1细胞的体外细胞毒性。将4T1细胞与不同浓度的PCN-CuS-JQ/RGD或PCN-CuS-RGD孵育24小时后，用1064 nm激光照射5分钟。照射后24小时测量细胞活力。结果显示，在没有激光照射的情况下，PCN-CuS-JQ/RGD和PCN-CuS-RGD均未对4T1细胞表现出显著毒性。然而，激光照射后，50 µg/mL PCN-CuS-JQ/RGD处理组的细胞活力显著下降至50%以下。为评估对正常细胞的潜在副作用，在293T和3T3细胞系上进行了CCK-8实验。结果显示无显著细胞毒性，表明良好的生物相容性，支持其体外安全性。
为了进一步研究抗肿瘤机制，检测了PCN-CuS-JQ/RGD在1064 nm激光照射下诱导的细胞凋亡水平。使用钙黄绿素-AM/PI进行活/死细胞染色。正如预期，PCN-CuS-JQ/RGD与激光照射的组合导致4T1细胞大量死亡，而PCN-CuS-RGD+L组仅观察到有限的细胞死亡。这表明PCN-CuS-JQ/RGD仅在激光照射存在下引发严重的细胞毒性。此外，流式细胞术分析证实了统计学上显著的凋亡增加。值得注意的是，在2.04 W/cm2 的1064 nm激光照射5分钟后，PCN-CuS-JQ/RGD组的凋亡细胞率从10.5%增加到65.1%。这些结果共同证明PCN-CuS-JQ/RGD在体外具有精确光控和显著的协同抗肿瘤功效。
2.4 活细胞中光触发BRD4降解与ICD诱导
为了研究光触发蛋白降解能力，评估了用PCN-CuS-JQ/RGD处理和激光照射后4T1细胞中BRD4的表达。蛋白质印迹分析表明，只有在PCN-CuS-JQ/RGD存在下进行激光照射时，BRD4蛋白水平才显著下调。这一观察结果证实了PCN-CuS-JQ/RGD纳米平台在没有光的情况下特异性结合BRD4蛋白而不诱导降解；相反，有效的降解主要是通过1064 nm激光照射诱导的光热效应实现的。此外，考虑到特异性降解肿瘤细胞中的BRD4可以显著降低PD-L1表达，从而增强抗肿瘤免疫反应，也评估了PD-L1的表达。观察到PCN-CuS-JQ/RGD联合激光照射处理后PD-L1显著下调。值得注意的是，在未照射的PCN-CuS-JQ/RGD组中也观察到PD-L1的显著降低。尽管纳米平台中的JQ1部分不直接降解BRD4，但已知它能抑制BRD4在CD274启动子区域的募集，因为CD274是BRD4的直接靶基因。因此，在未照射组观察到的PD-L1减少可能归因于JQ1介导的转录抑制。
此外，BRD4的下调和PTT的应用都可以激活ICD。与免疫沉默的凋亡不同，ICD的特征是细胞死亡过程中特异性释放损伤相关分子模式。这里检测了钙网蛋白的细胞表面暴露和高迁移率族蛋白B1的核释放。免疫荧光染色显示，与对照组相比，PCN-CuS-JQ/RGD+L组CRT暴露显著增加，核HMGB1水平显著降低。这些结果证实了PCN-CuS-JQ/RGD在激光照射激活下可以有效诱导ICD。
2.5 PCN-CuS-JQ/RGD的体内生物分布
为了研究体内肿瘤靶向效率和生物分布，利用了近红外荧光成像。将荧光染料吲哚菁绿封装在纳米平台内，制备PCN-CuS-JQ/RGD@ICG。给4T1荷瘤小鼠静脉注射PBS、游离ICG或PCN-CuS-JQ/RGD@ICG。与注射游离ICG的小鼠相比，接受PCN-CuS-JQ/RGD@ICG的小鼠在肿瘤部位显示出显著更强的荧光信号，表明其优异的体内肿瘤靶向和保留能力。注射后48小时处死小鼠，获取肿瘤和主要器官的离体荧光图像和统计分析。结果与体内成像数据一致，证实了纳米系统优异的肿瘤靶向和保留能力。
基于这种验证的肿瘤积累，评估了PCN-CuS-JQ/RGD的体内T1 加权MRI能力，这归因于PCN(Fe)框架内固有的顺磁性Fe3+ 。给荷瘤小鼠静脉注射PBS、氯化铁或PCN-CuS-JQ/RGD。在PCN-CuS-JQ/RGD组的肿瘤区域观察到T1 信号强度显著的时间依赖性增强，而对照组未见显著对比度变化。这些结果共同证明PCN-CuS-JQ/RGD作为一种有效的T1 加权MRI对比剂，能够可视化体内肿瘤积累。
2.6 PTTAC策略的体内抗肿瘤功效
受到有希望的体外细胞毒性和已证实的肿瘤积累的鼓舞，评估了PTTAC策略的体内抗肿瘤功效。通过热成像证实了PCN-CuS-JQ/RGD在体内的光热性能，显示温度在5分钟内从约36°C迅速升高至45°C，这足以诱导热损伤和广泛的蛋白变性。建立4T1荷瘤小鼠模型，并随机分为五组：PBS对照组、PCN-CuS-RGD组、PCN-CuS-RGD+L组、PCN-CuS-JQ/RGD组和PCN-CuS-JQ/RGD+L组。通过尾静脉注射纳米材料，并在注射后24小时应用激光照射。该治疗周期每三天重复一次，共五个周期。在整个治疗期间，每三天记录一次肿瘤体积和小鼠体重。未照射组表现出快速且不受控制的肿瘤生长，证实了纳米平台具有可忽略的暗毒性，需要激光激活进行治疗。仅PTT组显示出中等的肿瘤抑制。值得注意的是，PTTAC组实现了有效的肿瘤抑制，并且显著优于仅PTT组。这一结果为体内协同效应提供了有力证据。此外，与PBS对照组相比，治疗组未观察到体重的显著波动，表明高系统耐受性。主要器官的血液生化和组织学评估未发现明显异常，进一步证实了PCN-CuS-JQ/RGD与1064 nm激光照射联合应用在体内的生物安全性。
为了在组织水平阐明治疗机制，治疗后收集肿瘤进行组织学分析。H&E染色图像显示，PTTAC组与其他治疗组相比表现出广泛的坏死区域。与此一致，Ki-67染色显示增殖活性最低，而TUNEL染色表明该组凋亡细胞百分比最高。关键的是，进行了免疫组织化学分析以评估BRD4蛋白表达。正如预期，PTTAC组显示BRD4蛋白水平显著下调，而其他组未观察到显著变化，证实了体内成功的光热介导降解。平行地，PD-L1的免疫荧光分析产生了一致的结果：虽然未照射的PCN-CuS-JQ/RGD组显示PD-L1水平适度降低（由于转录抑制），但PTTAC组表现出最显著的抑制。这些结果共同证明PTTAC策略通过光控的协同机制，涉及BRD4降解和PD-L1抑制，有效抑制体内肿瘤生长。
2.7 体内抗肿瘤免疫反应
如上所述，PCN-CuS-JQ/RGD在激光照射下选择性降解BRD4，并且PTT的应用协同产生抗肿瘤免疫反应。为了阐明PTTAC策略强大体内功效背后的免疫机制，在第15天治疗后对每组小鼠的肿瘤进行了免疫荧光分析。结果显示，与所有其他组相比，PTTAC组表现出ATP分泌和CRT暴露显著增加，同时伴随核HMGB1的显著丢失。虽然仅PTT组也表现出反应，但远弱于PTTAC组，证实了BRD4降解在促进ICD中的协同作用。此外，肿瘤免疫荧光染色显示PTTAC组肿瘤部位CD3+ 、CD4+ 和CD8+ T细胞显著增加。这表明PCN-CuS-JQ/RGD与激光照射的组合促进了细胞毒性T细胞和效应T细胞在肿瘤中的募集和功能，从而增强了抗肿瘤免疫反应。这些发现通过流式细胞术分析进一步定量验证。
为了进一步描述系统性免疫激活，分析了树突状细胞的成熟和免疫抑制细胞的状态。与其他组相比，PTTAC组显示淋巴结中成熟DC（CD11c+ /CD80+ ）群体显著增加。这表明抗原呈递和T细胞启动增强，这是启动系统性免疫反应的关键步骤。此外，评估了调节性T细胞的频率。结果显示，与其他组相比，PTTAC组的Treg频率显著降低，证实了该组肿瘤免疫抑制的显著减少。此外，通过量化自然杀伤细胞评估了先天免疫系统的贡献。流式细胞术分析显示，PTTAC组的NK细胞数量最高。为了进一步表征这些浸润NK细胞的活化状态，进行了NKp46和颗粒酶B的免疫荧光染色。成像结果表明，PTTAC组的NK细胞不仅表现出对肿瘤组织的浸润增强，而且达到了更高水平的功能活化。这些发现共同证明PTTAC策略不仅直接杀死肿瘤细胞，而且重塑肿瘤免疫微环境，有效实现了强大且系统性的抗肿瘤免疫治疗。
2.8 双侧肿瘤模型中的协同免疫治疗与远隔效应
在确定PTTAC策略诱导强大ICD和T细胞浸润后，接下来试图确定这种局部治疗是否能引发系统性抗肿瘤免疫反应并与免疫检查点封锁协同。选择抗PD-L1抗体以减轻免疫抑制并放大系统性反应。建立双侧4T1肿瘤模型，右侧为原发性肿瘤，左侧为远处未治疗肿瘤以模拟转移。将这些双侧荷瘤小鼠随机分为四组：PBS组、aPD-L1组、PCN-CuS-JQ/RGD+L组和aPD-L1+PCN-CuS-JQ/RGD+L组。小鼠在第0、3、6和9天接受PCN-CuS-JQ/RGD静脉注射，激光组在每次注射后24小时接受1064 nm激光照射。关键的是，激光照射仅应用于原发性肿瘤。在第0和6天进行aPD-L1腹腔注射。每三天记录两侧的肿瘤体积。在第12天处死小鼠，收集肿瘤，拍照并称重。在原发肿瘤中，PTTAC组和联合组均实现了显著的肿瘤抑制，两者之间无显著差异。这表明局部PTTAC治疗已经达到最大效果。最关键的结果出现在远处肿瘤。与PBS对照组相比，aPD-L1单药治疗和PTTAC治疗均实现了中等且统计学显著的肿瘤生长抑制。值得注意的是，这两个单药治疗组之间没有统计学差异，表明它们都提供了相似水平的系统性免疫反应，但达到了治疗平台期。与此形成鲜明对比的是，联合组表现出明显增强的抑制，在统计学上优于aPD-L1单独组和PTTAC单独组。这些结果为强大的协同效应提供了令人信服的证据。虽然ICB或PTTAC介导的原位免疫均能提供显著益处，但单独使用并不完全有效。然而，它们的组合释放了统计学上显著的治疗优势，使检查点抑制剂能够放大系统性抗肿瘤反应，并实现对远处未治疗转移瘤的增强控制。
3 结论
总之，我们开发了一种创新的PTTAC策略来克服传统PROTACs的固有局限性，特别是它们对有限E3连接酶库的依赖和缺乏时空控制。我们成功构建了诊疗一体化纳米平台PCN-CuS-JQ/RGD，它集成了NIR-II光热转换、MRI引导和复杂的GSH响应逐步递送机制。该系统通过局部高温实现了核蛋白BRD4的高度精确、光激活降解。关键的是，这种PTTAC策略超越了单纯的肿瘤消融。我们证明了光触发BRD4降解与PTT协同，诱导了显著的ICD并有效下调了PD-L1表达。这一过程成功重塑了免疫抑制性肿瘤微环境，促进了从冷肿瘤向热肿瘤表型的转变。值得注意的是，这种免疫调节转化为强大的系统性抗肿瘤反应，如显著的远隔效应所证明。当与抗PD-L1检查点封锁结合时，我们的PTTAC策略表现出强大的协同效应，在双侧肿瘤模型中导致优异的肿瘤抑制。此外，该平台的模块化设计不仅限于BRD4。通过替换靶向配体，这种PTTAC概念提供了一个多功能平台，有潜力适应广泛的蛋白质靶点，包括膜、核和细胞质靶点。我们的工作提出了一种新颖的光介导精确蛋白降解方法，为推进癌症免疫治疗提供了强大且有前景的策略。
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