摘要
肺免疫系统在感染期间动态平衡病原体清除与炎症调节以维持组织稳态。虽然宿主专业吞噬细胞（如巨噬细胞）通过病原体“隐匿”来减弱过度炎症反应的能力已得到证实，但非专业吞噬细胞在此过程中的作用尚属未知。本研究揭示了一种先前未被认识的机制：肺上皮细胞（LECs）在金黄色葡萄球菌（S. aureus）感染期间通过释放细胞外囊泡（EVs）来协调细菌“隐匿”，从而减轻炎症反应。遭受S. aureus攻击的LECs迅速释放携带表面受体（如纤连蛋白和纤维蛋白原γ）的EVs，这些受体能够结合入侵的细菌并形成EV-细菌复合物。随后，该复合物通过RhoA-ROCK1-肌动蛋白驱动的内吞途径被LECs内化，减少了肺泡腔内的自由细菌负荷。这种EV介导的病原体“隐匿”在急性期起到了保护作用，表现为减轻了早期肺部炎症，并提高了感染小鼠的存活率。但矛盾的是，这一策略也允许了细菌的慢性持续存在，并维持了低度炎症。这些发现勾勒出非专业吞噬细胞通过病原体“隐匿”来调节急性细菌感染和炎症反应的权衡机制，从EV介导的宿主-病原体相互作用角度重塑了非专业吞噬细胞作为感染结局积极塑造者的角色。
1 引言
肺部感染期间，过度的中性粒细胞浸润常导致急性肺损伤（ALI）。肺泡巨噬细胞（AMs）已被证明可通过吞噬和“隐匿”S. aureus来主动防止中性粒细胞过度激活。然而，每个肺泡中仅有一个巨噬细胞的巨大数量差距限制了其在急性感染期间抵抗细菌入侵的有效性。因此，早期病原体“隐匿”和炎症调节的确切细胞机制仍未完全阐明。
作为肺免疫的哨兵界面，肺上皮细胞（LECs）通过多种防御策略对抗入侵病原体。尽管近期观察揭示了上皮细胞对细菌的吞噬作用，但此过程是否类似于专业吞噬细胞发挥病原体“隐匿”功能仍不明确。
宿主来源的细胞外囊泡（hEVs）在细菌感染期间扮演双重角色，既介导保护性免疫，又能使病原体传播和入侵。然而，hEVs在促进细菌内化的同时支持宿主防御的矛盾功能仍不明确。
本研究揭示了一条免疫调节轴，即LECs在S. aureus感染期间通过其释放的EVs协调细菌“隐匿”，以防止急性致死性肺部炎症。在S. aureus诱导的急性肺炎小鼠模型中，S. aureus刺激LECs释放携带表面受体的EVs，这些受体可结合游离的S. aureus。由此形成的EVs-S. aureus复合物（EVs-SA）通过RhoA-ROCK1-肌动蛋白驱动的内吞途径被宿主LECs内化，促进了细菌在LECs内的“隐匿”。这种策略性的病原体“隐匿”显著减轻了肺部炎症并改善了致死性感染小鼠的生存结局，但代价是长期细菌定植和慢性感染引起的持续炎症。总之，这些发现勾勒出一条先前未被认识的调节通路，即上皮屏障通过EVs介导的病原体“隐匿”动态调节感染结局。这种EVs介导的细菌“隐匿”策略代表了一种进化上的权衡，暂时牺牲病原体清除以预防致命的免疫病理。
2 结果
2.1 抑制LuEV释放减少细胞内细菌定植并加重S. aureus诱导肺炎的肺部炎症
在S. aureus诱导的急性肺炎小鼠模型中，观察到肺组织和循环中的EV水平显著增加。通过施用EV生物发生抑制剂GW4869来药理抑制EV释放，有效降低了感染后24小时肺组织和循环中的EV水平。EV的减少与组织驻留S. aureus定植水平的显著下降相一致。免疫荧光分析进一步证实，抑制LuEV释放减少了LECs内化的S. aureus。尽管抑制EV释放有效降低了LECs内的细菌负荷，但S. aureus感染小鼠模型却表现出死亡率增加的矛盾现象。
对S. aureus感染小鼠抑制LuEV释放后的肺部炎症和组织损伤进行系统分析。组织学分析显示，GW4869预处理加剧了S. aureus诱导的急性期（感染后24小时）肺损伤，表现为近乎完全的肺泡破坏、出血性实变和炎症浸润。统计分析表明，与S. aureus感染小鼠相比，GW4869处理的感染组在24小时的组织病理学评分显著增加，而到感染后5天则未观察到显著性，表明抑制LuEV释放介导的肺部炎症加剧具有急性期特异性。免疫荧光也证实，在GW4869处理的S. aureus感染小鼠的肺部，中性粒细胞募集、巨噬细胞浸润和C反应蛋白（CRP）表达在感染后24小时和5天均升高。此外，虽然GW4869处理与未处理的S. aureus感染组之间在24小时的脾脏病变组织病理学评分无显著差异，但到感染后5天，GW4869也导致了脾脏实质的明显结构破坏和炎症灶形成。
总之，这些发现表明抑制LuEV释放减少了LECs内的S. aureus定植并加剧了早期肺部炎症，为肺组织来源的EVs介导宿主LECs在感染早期内化S. aureus提供了直接证据。
2.2 肺上皮细胞-EVs介导细胞内S. aureus“隐匿”并减轻炎症损伤
为阐明LuEVs在S. aureus感染期间细菌被LECs内化和炎症调节中的作用，从磷酸盐缓冲盐水（PBS）/S. aureus处理的小鼠肺组织中分离了EVs进行详细分析。透射电子显微镜（TEM）显示了典型的杯状形态的脂质双层包裹囊泡，纳米颗粒跟踪分析（NTA）得出的粒径分布曲线峰值约为160纳米。免疫印迹证明了EV标志物（CD9、CD63、TSG101和Alix）的阳性表达，以及两种EVs中内质网标志物钙联接蛋白的阴性表达。这些结果证实了从肺部成功分离出EVs，且其基本物理特性未因感染而改变。
接下来，通过将来自感染小鼠的LuEVs重新补充到GW4869预处理的感染小鼠体内进行挽救实验。离体成像和肺组织细菌定量显示，LuEVs重新补充显著逆转了因EV抑制而诱导的S. aureus定植水平降低。免疫荧光染色也显示，与GW4869预处理的感染小鼠相比，LuEVs处理后LECs内的细菌负荷增加了4.9倍。体重监测进一步证实，重新补充LuEVs部分缓解了因EV抑制导致的严重感染相关的体重下降。值得注意的是，重新补充LuEVs将EV耗竭的感染小鼠的存活率从0%显著提高至感染后60小时的90%。组织学分析显示，LuEVs处理显著减轻了EV抑制诱导的严重炎症损伤，表现为肺和脾脏的组织破坏和炎症细胞浸润减少。
为进一步确定LuEVs的来源，分析了其表面标志物。大部分LuEVs（73.3%）来源于上皮细胞（EpCAM+ ），而免疫细胞来源的EVs（LY6G+ : 7.22%; F4/80+ : 3.82%）占一小部分。为在功能上验证这一点，通过敲低LECs中的Rab27a特异性抑制LECs的EV释放，这导致总体EV释放和LuEVs中EpCAM阳性EVs比例显著降低。因此，特异性抑制LECs-EVs显著降低了LECs内的细菌定植水平，并且LuEVs促进细菌内化的能力也降低了。这些结果证实LECs是LuEVs的主要来源，并且这些上皮来源的EVs负责在感染期间促进细菌内化。
为确证LECs释放的EVs促进细菌内化的结论，使用经典的LEC细胞系A549细胞进行体外验证。首先，分离了不同条件下A549细胞来源的EVs（AEVs）并进一步研究。AEVs显示出与LuEVs相同的物理特性，并且在S. aureus感染后以更高浓度释放。为阐明AEVs在S. aureus被LECs内化中的作用，将S. aureus与来自S. aureus感染的A549细胞的EVs（AEVs + SA）预混合，然后感染经GW4869耗竭EV的小鼠。重新补充AEVs重现了LuEVs的效果，增加了GW4869预处理感染小鼠的细菌定植水平，同时改善了生存结局并减轻了炎症组织损伤。总之，这些数据证明LECs在S. aureus感染期间通过释放EVs介导细菌“隐匿”，从而保护宿主免受过度炎症损伤。
2.3 肺上皮细胞-EVs通过受体依赖性结合介导S. aureus“隐匿”
S. aureus利用一系列表面粘附素，如纤连蛋白结合蛋白（FNBP）、血管性血友病因子结合蛋白（vWbp）和凝聚因子A（ClfA）来介导对宿主细胞的粘附和入侵。EVs是细胞来源的膜结合产物，表达与其亲本细胞相似的表面受体。免疫印迹证明，纤连蛋白（FN）和纤维蛋白原γ（S. aureus通过FNBPs和ClfA粘附的关键宿主受体）在LuEVs和AEVs上表达。具体而言，S. aureus感染显著增加了这些受体在LuEVs上的富集。此外，S. aureus分泌的葡萄球菌蛋白A（SPA）也上调了AEVs上FN和纤维蛋白原γ的表达。这表明细菌感染和特定毒力因子暴露都增强了这些粘附受体在EVs上的富集。
有趣的是，S. aureus或SPA处理触发了一种宿主防御反应，其特征是EV分泌增加，同时策略性地下调了A549细胞表面的纤连蛋白表达，这强调了EVs是细胞在感染时主动排出和中和细菌的功能载体。因此，通过更换培养基去除SPA诱导的EVs（SPA-AEVs）也显著降低了细胞内S. aureus负荷。这些发现表明，LECs在细菌刺激下释放受体表达上调的EVs，其可能作为介质通过受体介导的结合促进与细菌的相互作用。
接下来，通过多种方法证实了AEVs与S. aureus的直接结合。来自TEM的超微结构证据显示了EVs与细菌之间的物理相互作用，而荧光成像的3D重建进一步可视化了它们在体外的空间关联。此外，免疫印迹证实了在不同EVs预处理的细菌沉淀物上存在宿主来源的CD9、CD81和TSG101。这些发现有力地验证了LEC-EVs通过其表面受体主动粘附到细菌表面以形成复合结构。为进一步阐明FN在EV-细菌相互作用中的具体作用，通过慢病毒介导的RNA干扰敲低了A549细胞中的FN表达。FN敲低的A549细胞释放的AEVs表面FN水平降低。重要的是，AEVsFN-KD 对S. aureus的粘附水平显著降低。
进行了更详细的功能测定以阐明EVs-S. aureus复合物（EVs-SA）在体外的作用和相互作用机制。初步证实，不同来源的EVs或GW4869给药均未对S. aureus的增殖动力学产生不利影响。此外，优化了细胞实验的感染条件，以确保相对较高的细胞活力，且不影响对细菌粘附和定植的观察。此外，溶葡球菌酶有效消除了细胞外游离细菌。在此基础上，S. aureus与AEVs预孵育形成的AEVs-S. aureus复合物以浓度依赖性方式显著增加了A549细胞内的细菌负荷，这与AEVs的摄取效率相关。此外，GW4869介导的A549细胞EV生物发生的药理学阻断显著减少了细菌“隐匿”，而预先形成的AEVs-S. aureus复合物促进S. aureus“隐匿”的能力基本不受GW4869处理的影响。与这一发现一致，Rab27a敲低介导的EVs抑制同样抑制了A549细胞中的S. aureus“隐匿”，但并未损害预先形成的AEVs-S. aureus复合物的效果，产生了与药理学阻断相似的结果。此外，与对照AEVs相比，AEVsFN-KD 促进细菌内化到A549细胞的能力减弱。这些发现表明，细菌感染期间LECs释放的EVs通过表面受体介导的结合在促进细菌“隐匿”中起关键作用。
值得注意的是，SPA-AEVs在介导LECs中细菌“隐匿”方面发挥了类似作用，这在群体和单细胞水平的细菌定量测定中得到了证明。免疫荧光分析显示，虽然AEVs不影响巨噬细胞的吞噬作用，但LuEVs适度增加了肺组织驻留巨噬细胞对S. aureus的摄取。值得注意的是，在LuEVs-S. aureus复合物处理的肺组织中，EpCAM+ 上皮细胞占所有S. aureus阳性细胞的69.5%，而F4/80+ 巨噬细胞占17.8%，证实了在体内上皮细胞对细菌“隐匿”的主导贡献超过巨噬细胞。
观察到的EV介导的细菌“隐匿”机制在其他一些细胞类型中具有广泛相关性。SPA也显著增加了人脐静脉内皮细胞（HUVECs）的EV分泌。同时，HUVEC在SPA刺激后产生的EVs（SPA-HEVs）也表现出对S. aureus的结合能力。此外，细菌定量和免疫荧光测定共同证明，SPA-HEVs显著增强了HUVECs对S. aureus的内化。这些实验中观察到的机制趋同性突显了SPA触发多效性细胞反应，诱导具有S. aureus特异性结合能力的EVs分泌。这种EV介导的过程最终促进了细菌在宿主细胞内的“隐匿”，暗示了跨多种细胞类型的保守策略。
2.4 EV-S. aureus复合物劫持小窝蛋白依赖性内吞作用进行细菌“隐匿”
在EVs结合细菌并形成复合物后，这些复合物被细胞摄取和内化的机制值得进一步研究。S. aureus通过一个明确的机制侵入上皮细胞，该机制涉及在细菌FNBPs和宿主整合素α5 β1 受体之间形成纤连蛋白桥，这可被FNBP的纤连蛋白结合域（D1-D4）的可溶性重组体有效抑制。重组纤连蛋白结合蛋白（FNBP）D1-D4肽段显著抑制了游离S. aureus的内化，但对AEVs-S. aureus复合物的内化效果有限。肺细菌定量显示，在相同实验条件下，FNBP介导的对AEVs-S. aureus复合物的细胞内定植抑制效果明显低于对游离S. aureus的抑制效果。这一发现提供了令人信服的证据，表明EVs-S. aureus复合物采用了一种不同于经典细菌内化模式的特有内化途径进入宿主细胞。
鉴于EVs-S. aureus复合物表面存在EVs及其组成，我们假设这些复合物主要通过依赖于EVs的内吞途径进入宿主细胞。随后，液泡ATP酶的有效抑制剂巴菲霉素A1（已知可抑制EV内吞作用）有效地抑制了用AEVs-S. aureus复合物处理的A549细胞内的细菌定植。为进一步明确特定的内吞途径，测试了途径特异性抑制剂的效果。值得注意的是，破坏小窝蛋白依赖性内吞作用的制霉菌素显著抑制了AEVs-S. aureus复合物的内化。相比之下，CPZ或阿米洛利均未产生明显的抑制作用，排除了网格蛋白依赖性内吞或巨胞饮机制的主要贡献。这些结果证实EVs-S. aureus复合物的内化主要通过小窝蛋白依赖性内吞途径发生。
越来越多的证据表明，小窝蛋白-1（CAV1）和Ras同源家族成员A（RhoA）在小窝蛋白依赖性内吞作用中起关键作用。RhoA是一种由CAV1激活的调节肌动蛋白细胞骨架的GTP酶，驱动细胞形态、迁移和囊泡运输。CAV1磷酸化诱导Rho激活，随后激活ROCK，最终导致黏着斑激酶（FAK）和Src的磷酸化。用AEVs-S. aureus复合物感染触发了强烈的CAV1磷酸化和ROCK1表达，启动了一个信号级联，激活了FAK和Src的磷酸化。
由于CAV1介导的脂筏依赖性内吞作用关键依赖于细胞表面的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（HSPG），无论是外源性硫酸乙酰肝素竞争性阻断HSPG结合位点，还是用肝素酶III酶促去除细胞表面HSPG，都显著削弱了AEVs-S. aureus复合物的内化，而对游离S. aureus的内化没有影响。
鉴于胆固醇在维持小窝内脂筏完整性中的重要作用，以及小窝蛋白依赖性内吞作用对胆固醇耗竭的敏感性，AEVs-S. aureus复合物的内化机制需要完整的脂筏微区。因此，MβCD介导的胆固醇耗竭和肝素介导的脂筏-HSPG相互作用的破坏都显著降低了AEVs-S. aureus复合物在A549细胞中的内化。针对信号通路中多个节点的药理学干预，靶向RhoA（Rho抑制剂I）和ROCK1（Y-27632），一致抑制了AEVs-S. aureus复合物进入宿主细胞的内化。细胞松弛素D也通过破坏肌动蛋白骨架抑制了AEVs-S. aureus复合物的内化，并削弱了细菌“隐匿”效应。ROCK1的关键作用在ROCK1敲除的A549细胞（A549ROCK1-KO ）中得到进一步确立，其缺失影响了EVs介导的细菌“隐匿”效应。与体外观察一致，体内用Y-27632药理学抑制ROCK1显著降低了肺组织驻留细菌并恶化了感染结局。
这些结果共同定义了一条非经典途径：EV-S. aureus复合物的形成通过RhoA-ROCK1-肌动蛋白驱动的内吞途径促进细菌“隐匿”，这与已明确的细菌内化机制不同。虽然这种EV介导的途径增强了早期细菌“隐匿”，有利于调节炎症反应，但其对疾病进展的长期影响仍有待充分阐明。
2.5 EVs介导的S. aureus细胞内定植驱动持久的慢性感染
数十年的研究已经巩固了这样一个概念：非专业吞噬细胞内化细菌会创造保护性的细胞内区室，从而促进免疫逃避和持续感染。为确定早期LECs“隐匿”S. aureus的长期影响，在感染后10天检查了感染小鼠的肺细菌负荷。简单的S. aureus感染显示，无论是否进行GW4869预处理，到感染后10天细菌几乎完全清除，而LuEVs-S. aureus复合物导致肺组织中S. aureus感染持续存在直至感染后10天，并伴有肺严重脓肿形成以及肺和脾脏持续的炎症细胞浸润。这种持续的细菌储存库引发了一种独特的细胞因子谱，其特征是IL-1β、IL-6和TNF-α水平在感染后10天延迟升高，与急性感染中观察到的短暂细胞因子激增形成鲜明对比。慢性肺部感染在病理学上定义为适应性免疫的持续激活，特别是通过B和T淋巴细胞的浸润。支气管肺泡灌洗液（BALF）的流式细胞术分析表明，虽然GW4869减弱了仅S. aureus感染中的淋巴细胞募集，但LuEVs-S. aureus复合物在感染后15天维持了升高的B细胞和T细胞群。这些发现共同证明，EVs介导的细胞内细菌“隐匿”诱导了肺组织中的持续感染和慢性炎症。
总之，我们的研究结果揭示了一种先前未被认识的机制，即非专业吞噬细胞利用细菌“隐匿”作为抵抗急性感染和确保宿主存活的策略。在这个范式中，细菌“隐匿”是在S. aureus感染期间通过LECs内EV协调的内吞途径进行的，这有助于减少游离细菌负荷并减轻急性期炎症病理。矛盾的是，这种相互作用使细菌能够利用这种“隐匿”机制形成持续的细胞内定植，从而逃避宿主免疫监视并导致慢性感染。因此，这种EV介导的细菌“隐匿”机制代表了宿主-病原体相互作用中的一种进化权衡，以潜伏的细胞内细菌感染为代价，实现在急性感染期间的存活。
3 讨论
压倒性的细菌挑战是肺部感染期间致死性炎症的主要驱动因素。除了免疫系统的直接抗菌作用外，新出现的证据表明，宿主采用病原体“隐匿”策略来实现免疫转换，从而避免直接对抗导致的附带组织损伤。本研究确立了LECs作为抵抗S. aureus诱导肺炎的主动炎症调节机制的关键介质。在急性感染期间，LEC来源的EVs作为诱饵捕获细菌，从而增强宿主细胞对病原体的内化和隔离。这种“隐匿”过程有效减轻了自由细菌负荷（炎症反应和肺组织破坏的主要驱动因素），最终提高了感染小鼠模型的存活率。虽然专业吞噬细胞的病原体“隐匿”已有充分记载，但其功效受到肺组织中组织驻留巨噬细胞数量有限的限制。进化上的考虑表明，LECs作为暴露于持续环境挑战的肺上皮的主要组成部分，必须具有内在的保护机制。本研究重新定义了LECs作为非专业吞噬细胞的病原体“隐匿”能力，证明其依赖于EV介导的细胞外病原体“隐匿”，而非直接的细胞内化。这项工作更新了传统范式，该范式仅将LECs定位为被动的屏障或炎症信号的放大器，而是通过证明其通过EV依赖性细菌“隐匿”机制对早期免疫调节的关键贡献，确立了其重要作用。
本研究阐明的分子机制展示了hEVs在细菌发病机制中的双重调节范式。与先前将EVs单维度地视为宿主来源的病原体防御系统（如铁螯合机制）或被病原体利用的入侵工具（特别是用于毒力因子递送）的观点相反，LEC来源的EVs被发现通过非经典机制参与宿主-病原体串扰。作为典型的胞外病原体，S. aureus诱导的急性肺部感染的特征是在感染后7天内以中性粒细胞为主的浸润。游离的S. aureus被宿主免疫系统迅速清除，不会在感染后48-72小时之后持续存在。为建立慢性S. aureus感染模型，需要额外的干预措施，例如琼脂糖珠包埋的细菌，以逃避快速的免疫清除并规避与大量感染相关的高死亡率，这种慢性感染持续7-14天，并以肺组织中淋巴细胞积聚的显著转变为标志。与这些已建立的感染范式一致，本研究通过EVs在情境依赖性的双重作用揭示了宿主-微生物相互作用中进化保守的免疫调节权衡。在急性感染期间，通过EV介导的“隐匿”进行空间限制显著减少了细胞外病原体暴露，代表了一种宿主优先的免疫调节策略，可减轻致命的过度炎症反应。相反，这种机制使病原体能够利用非经典内化途径形成细胞内生态位，构成了一种病原体衍生的免疫逃避策略，符合成本效益权衡原则。这种双向相互作用突显了宿主可能忍受次优的病原体清除以获得急性期生存优势，而病原体则利用hEVs作为免疫特权载体进行持续定植。总之，双重作用突出了EV介导免疫的复杂性，并强调了解剖情境特异性调节机制的必要性。
本研究从囊泡生物学的角度为慢性肺炎的临床难题提供了见解，为开发EV-病原体界面靶向治疗策略奠定了理论基础。在急性期，通过外源性EV给药或RhoA激动剂增强EV介导的细菌“隐匿”，可以加速细菌“隐匿”并减轻过度炎症反应。相比之下，在慢性阶段，干预措施应侧重于调节EV生物发生，以防止EV介导的细胞间细菌传播。更重要的是，应 设 计 纳 米 载
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