Abstract
本研究针对转移性结直肠癌（mCRC）标准化疗方案FOLFIRI（5-氟尿嘧啶联合伊立替康）响应率仅约50%的临床挑战，利用127个患者来源异种移植（PDX）模型系统解析了化疗响应的异质性机制。研究发现，FOLFIRI耐药模型天然免疫与线粒体代谢相关基因转录上调，且DNA聚合酶POLD1表达降低；敏感模型则呈现BRCAness样表型，伴随同源重组（HR）缺陷相关的基因组瘢痕，这种缺陷并非由HR通路基因遗传或表观遗传失活引起，而是源于RAD51重组酶低表达。在类器官模型中，强制过表达RAD51可减弱HR缺陷相关瘢痕并缓解化疗损伤，而通过ATM阻断抑制HR则可增强药物敏感性。关键响应决定因素的预测价值在临床样本中得到验证，本研究揭示了mCRC中BRCAness的功能性非遗传特征，为临床决策优化和化疗耐药患者治疗选择拓展提供了新型生物标志物和靶点。
Introduction
结直肠癌是全球第三大常见癌症，约占所有癌症病例的10%，是癌症相关死亡的第二大原因。约20%的结直肠癌在初诊时已发生转移，近半数局限性结直肠癌患者最终会发展出转移灶。对于不适合手术的微卫星稳定（MSS）转移性疾病患者，系统性化疗是主要治疗手段，序贯或联合应用氟尿嘧啶、奥沙利铂和伊立替康可使中位总生存期（OS）达到18至26个月。然而，当前细胞毒性治疗仍遵循“一刀切”模式，仅部分患者获得临床获益，多数患者承受不必要的治疗毒性。例如，一线FOLFOX（氟尿嘧啶+奥沙利铂）或FOLFIRI（氟尿嘧啶+伊立替康）的缓解率约为55%，二线设置中降至不足10%。
mCRC化疗敏感性与耐药性的生物学机制仍不明确，且缺乏临床可用的响应生物标志物。早期小规模患者队列研究提出，参与DNA损伤核苷酸切除修复的内切酶编码基因ERCC1可能是奥沙利铂耐药的潜在决定因素，但该关联在更大规模随机试验中未获证实。对于伊立替康，不良反应与药物外排转运体ABCG2高表达及其主要分子靶点拓扑异构酶I（TOP-I）低水平相关。此外，基于基因表达的分类器模型提出FOLFIRI响应与富集细胞粘附和WNT信号通路的转录特征相关。尽管取得这些进展，此类预测模型大多仍处于探索阶段，尚未转化为临床实践。因此，寻找能够指导治疗决策、辅助甄别治疗失败患者的预测性生物标志物仍是未满足的医疗需求。
大型PDX库忠实地反映了人类肿瘤的分子多样性，规模可与临床试验相媲美，同时允许系统性的药物响应注释。因此，它们作为可实验验证的药物基因组学平台，对于识别特定响应类别中优先代表的分子特征具有重要价值。就mCRC而言，PDX资源促进了抗EGFR抗体西妥昔单抗（一种常用于转移环境的靶向药物）低响应性生物标志物的提名与临床开发。基于PDX的研究还记录了在5-FU敏感的结直肠肿瘤中，与非恶性肠细胞和杯状细胞相似的转录特征表达更显著；或在西妥昔单抗治疗后存活的mCRC残留细胞中，与正常肠道分泌前体静息亚群相似的模式。
本研究旨在全面描绘大量mCRC PDX模型系列中对化疗的响应谱。这项工作结合匹配类器官的多维分析和生物学实验，为探索响应和耐药机制及发现生物标志物奠定了方法学基础。出于观察到的小鼠宿主轻度毒性相关的实践和伦理原因，我们选择FOLFIRI作为PDX群体试验的参考治疗，并分析了按治疗结果差异分层的分子富集情况。
Distribution of FOLFIRI Response in a PDX Population Trial
我们在127个主要来自MSS病变的mCRC PDX模型中评估了FOLFIRI的响应，每个模型源自不同患者，涵盖了mCRC中观察到的患者间和肿瘤间异质性谱。每个样本用于在NOD/SCID小鼠中建立皮下异种移植物，并传代直至形成7只动物的实验组。在该组中，2只动物接受安慰剂，5只动物在肿瘤达到约300 mm3的平均体积时施用FOLFIRI。
剂量和方案采纳自先前研究，旨在反映人体血浆浓度。治疗持续6周，首次给药后3周进行初步评估。或者，在达到预定义的人道终点时终止治疗。为分类响应模式，我们采用了受临床标准启发的类别：回归指治疗队列中每个模型的平均肿瘤体积相对于基线减少至少50%；进展指体积增加至少35%；稳定包括不符合回归或进展标准的中间响应。
图1B显示了整个PDX集合中早期（3周）对FOLFIRI的响应率分布，模型按治疗第一天基线相对肿瘤体积变化排序。在该群体中，54例（42.5%）显示进展，57例（45%）显示疾病稳定，16例（12.5%）显示回归。35个模型（27.5%）的小鼠在6周评估期结束前达到人道终点，因此92个案例可获得长期（6周）疗效数据。在该子集中，响应深度增加，33个模型（36%）显示肿瘤缩小超过50%。具体而言，在第二个观察期，先前分类为稳定的19个案例显示回归，最初进展的14个案例变为稳定。进展者总计26个（28%），但需承认此类别因携带大肿瘤的小鼠在最终分析前被提前处死而虚假减少。总体而言，这些响应率与用FOLFIRI治疗的mCRC患者中观察到的异质性化学敏感性一致。
对于大多数模型，我们通过全外显子组或靶向下一代测序获得了伴随的突变信息。因此，我们试图探索一些高频或生物学相关基因突变在不同响应类别中是否差异呈现。观察到的唯一显著富集是耐药病例中的KRAS突变。有趣的是，KRASG12突变最近已成为对5-FU相关组合疗法（曲氟尿苷/替吡拉西）耐药的生物标志物。
Gene Expression Signatures and Response to FOLFIRI
我们对84个未经治疗的PDX模型进行批量RNA测序分析，以鉴定化疗耐药肿瘤（n = 33，治疗3周后肿瘤体积增加52.62%至+297.09%）和化疗敏感肿瘤（n = 33，肿瘤体积缩小-7.81%至-88.62%）之间的差异表达基因（DEG）。该分析鉴定出22个在耐药模型中显著上调的基因和40个在响应模型中显著上调的基因（分别为19和36个蛋白质编码基因）。为确定基因表达调控程度是否与FOLFIRI响应程度相关，我们计算了治疗后肿瘤体积百分比变化与耐药vs敏感PDX模型中差异基因表达水平之间的Pearson相关系数。在耐药模型中上调的基因倾向于与肿瘤体积变化正相关（即表达越高与肿瘤进展相关），而在敏感模型中富集的基因显示负相关（即表达越高与肿瘤回归相关）。具体而言，在耐药模型中上调的22个基因中的11个和在敏感模型中上调的40个基因中的23个，在整个队列中与治疗响应的大小和方向存在名义显著关联。
在耐药肿瘤中显著上调的基因中，我们发现了与肠道炎症、天然免疫和1型干扰素（IFN）基因相关的共性。具体例子包括抑铁转运蛋白脂质运载蛋白-2（LCN2）、抗菌剂CRP-ductin（DMBT1）和诱导型一氧化氮合酶（NOS2）、促炎介质钙蛋白酶-9（CAPN9）和SPINK4，以及有助于维持肠粘膜完整性的杯状细胞衍生分子，如糖结合凝集素intelectin-1（ITLN1）和粘蛋白样糖蛋白IgG Fc结合蛋白（FCGBP）。另一个在耐药PDX中显著上调的基因是STAG3，其编码参与姐妹染色单体凝聚的蛋白质。相反，在响应肿瘤中显著上调的许多基因编码涉及上皮再生、细胞运动和伤口愈合的细胞骨架和细胞外基质蛋白。这些包括纤溶酶原激活物抑制剂-1（SERPINE1）、波形蛋白（VIM）、微纤维相关蛋白4（MFAP4）、vestigial样家族成员3（VGLL3）、spondin-2（SPON2）、嗅介蛋白样2A（OLFML2A）、上皮膜蛋白3（EMP3）、胶原蛋白α-1(VI)链（COL6A1）、胶原蛋白α-1(VII)链（COL7A1）和层粘连蛋白亚基α-5（LAMA5）。
基因集富集分析（GSEA）证实，宿主防御通路——包括IFNα和IFNγ响应以及JAK-STAT信号——在耐药肿瘤中上调，而上皮细胞运动和侵袭[上皮-间质转化（EMT）]的特征在响应肿瘤中富集。与低响应肿瘤相关的其他特征包括线粒体脂肪酸代谢的标志，而与结直肠癌高增殖活性相关的通路（MYC和WNT/LEF1靶点；β-连环蛋白信号）在响应者中富集。值得注意的是，在三阴性乳腺癌（TNBC）患者中，对新辅助铂类化疗未达到病理完全缓解的患者也记录了类似的耐药相关线粒体代谢通路，而对铂类化疗有病理完全缓解的TNBC患者中也 prominent 了敏感性相关的细胞周期通路。
为评估观察到的基因集富集模式与PDX群体中FOLFIRI响应的关系，我们使用单样本GSEA（ssGSEA）在个体PDX水平计算通路活性。ssGSEA得分分布与响应类别之间出现普遍一致性趋势；在大多数情况下，最大差异发生在极端组（耐药和敏感三分位数）之间，而非极端组与中间组（中间三分位数）之间。对于一些细胞增殖相关GSEA特征，这些差异具有统计学显著性。总体而言，尽管GSEA富集特征与FOLFIRI响应谱之间的相关性是明显的，但它们不如单个基因观察到的相关性稳健，可能反映了所检查的GSEA定义通路捕获的更广泛的生物学过程。
我们在PDX模型中的结果与结直肠癌的临床前和临床观察一致。在基于细胞的实验中，脂质运载蛋白-2、STAG3、IFN刺激基因和JAK-STAT信号与5-FU和伊立替康耐药相关，而上皮-间质转化（EMT）诱导显示增加化学敏感性。临床上，纤溶酶原激活物抑制剂-1是一个四蛋白特征的一部分，该特征识别对辅助化疗有良好响应的高风险早发性结直肠癌患者，而脂肪酸氧化基因的高表达与不良响应相关。此外，与我们发现的响应PDX模型中WNT靶基因表达升高一致，属于Marisa分类C5转录亚型的mCRC肿瘤——以高WNT信号为特征——在FOLFIRI响应患者中更普遍。
我们从FIRE-3试验中460名KRAS exon 2野生型mCRC患者的基因表达数据中挖掘，这些患者被随机分配接受西妥昔单抗或抗VEGFA抗体贝伐珠单抗联合FOLFIRI作为一线治疗。使用基因集变异分析（GSVA），我们计算了两个元基因的单样本富集得分：一个包含FOLFIRI耐药PDX中所有显著上调的基因，另一个包含FOLFIRI敏感PDX中所有上调的基因。通过应用0的自然截断值，我们发现肿瘤显示耐药相关元基因得分高于阈值的患者显著富集于较低的客观缓解率和较短的无进展生存期（PFS）和OS。这种富集不受西妥昔单抗或贝伐珠单抗治疗偏倚，表明观察到的预测价值特定于FOLFIRI响应。尽管我们基于PDX的转录组分析证明对预测耐药患者有用，但它们不能可靠地识别那些从FOLFIRI获得临床获益的患者，暗示敏感性基因背后的生物学可能普适性较差。
Validation of a Reference Subset of PDX Models for Biomarker Discovery Studies
我们设计了一系列系统研究，用于使用暴露于FOLFIRI 6周后显示明显进展（n = 14）或大量回归（n = 15）的PDX模型的参考子集进行生物标志物发现和验证。为确认该子集代表更大队列，我们首先验证了区分敏感与耐药肿瘤的转录模式在这些选定模型中被保留。确实，在整个集合中观察到的基因表达差异在参考子集中得以维持。在完整队列中敏感与耐药肿瘤之间显著调控的55个蛋白质编码基因中，26个（47.3%）在参考子集中也显示名义显著、方向一致的变化，并且完整队列中区分响应者与非响应者的所有GSEA通路在参考子集中同样富集。
在基线差异表达的基因中，少数（10/26, 38.5%）被治疗显著上调，要么仅在敏感模型中（四个基因：CHRD、COL7A1、GALNT8和STAG3），要么在敏感和耐药模型中均上调（五个基因：ENO3、KIAAIP49、QKI、VGLL3和VIM），在响应者中观察到总体更强的诱导。只有一个基因ITLN1在耐药病例中选择性上调。在10个治疗调控基因中，7个是敏感性相关特征的一部分，主要涉及细胞运动和侵袭，而3个与耐药相关。值得注意的是，没有一个基线DEG被治疗显著下调。因此，FOLFIRI暴露诱导了所分析基因的微弱但可辨别的调控，主要涉及响应相关亚群的适应性过表达，在敏感肿瘤中效果更明显。
由转录组观察指导的免疫组织化学（IHC）评估证实，敏感肿瘤对活跃细胞周期阶段的典型标志物（细胞周期蛋白A2、细胞周期蛋白B1和磷酸化组蛋白H3，分别指示S期、G2期和M期）显示更强的阳性，与耐药对应物不同。正如预期，敏感肿瘤的治疗后（6周）样本中S、G2和M细胞周期标志物水平降低，而它们在耐药肿瘤中基本未改变。基于流式细胞术的类器官细胞周期分析显示，FOLFIRI敏感性与更高比例的G2和M期细胞相关，支持有丝分裂活性加速与有利治疗结果之间的联系。
Functional and Molecular Analysis of DNA Damage Response according to FOLFIRI Sensitivity
伊立替康稳定TOP-I-DNA复合物，导致细胞周期S期形成一端DNA双链断裂（DSB）。类似地，5-FU通过抑制胸苷酸合成酶和氟脱氧尿苷三磷酸误掺入基因组DNA，驱动核苷酸不平衡，促进DSB积累。这些复制相关DSB主要通过同源重组（HR）通路修复；如果未修复，它们可能成为损害基因组完整性的致死损伤。尽管DNA修复通路日益被认为是各种癌症化学敏感性的调节剂，但它们对结直肠癌化疗响应的贡献仍知之甚少。为研究FOLFIRI敏感肿瘤是否因其修复DSB能力有限（由HR机制缺陷支撑）而更易受其基因毒性效应影响，我们采取了几种正交方法，围绕HR缺陷（HRD）的功能读数和分子探究展开。
Biological Assessment of DNA Damage Response
我们首先使用γ-H2AX染色分析了参考子集中敏感和耐药PDX样本的基线DSB丰度和化疗后DSB积累，这提供了DSB产生和修复的间接测量。治疗前γ-H2AX表达水平在两个队列之间相当。然而，与FOLFIRI易感性取决于基因组损伤的假设一致，我们观察到治疗后缩小的肿瘤中γ-H2AX阳性率显著高于进展肿瘤。值得注意的是，治疗后γ-H2AX诱导幅度与肿瘤化学敏感性程度显著相关，支持细胞积累DNA DSB的能力与FOLFIRI响应深度之间的关联。化疗后响应者和非响应者之间DSB形成的这些变化在20个PDX衍生类器官集合中使用中性彗星 assay（检测DSB的独立方法）得到进一步证实。
我们接下来使用源自8个FOLFIRI敏感和8个FOLFIRI耐药PDX模型的类器官检查了对PARP阻断的响应，利用HR缺陷肿瘤中PARP是合成致死靶点的知识。尽管对PARP抑制剂奥拉帕利的响应在个体模型间可变，但FOLFIRI敏感组总体表现出更大的易感性，反映为显著较低的IC50值。这些发现表明，尽管模型间存在异质性，FOLFIRI敏感肿瘤通常比其FOLFIRI耐药对应物更容易受PARP抑制影响。
collectively，上述观察表明FOLFIRI敏感mCRC肿瘤比FOLFIRI耐药肿瘤的DSB修复能力差，可能由于HR基因缺陷。因此，我们仔细检查了44个相关DNA损伤响应基因的手工策划 panel，这些基因直接或间接涉及HR通路，在84个具有不同FOLFIRI响应的PDX模型中寻找非同义体细胞突变的存在。其中，40个模型在治疗3周后进展35%至297%，而23个显示肿瘤缩小18.4%至88.6%。43个模型（51.2%）共有132个HR基因突变，大多数显示多于一个基因的改变。这些突变的绝大多数（89%）是杂合子，只有29个（22%）被多个独立算法一致预测为有害。当考虑所有突变时，未观察到HR基因变异与治疗结果相关的富集。预测的纯合子功能丧失变异不常见——仅影响12个基因——并作为孤立事件发生在12个个体模型中，与敏感性或耐药性没有明确联系。然而，我们注意到，一个携带TOP3A双等位基因有害突变的模型和另一个具有TOP3B类似突变的模型都对FOLFIRI耐药。
为补充突变分析，我们采用低深度全基因组测序探索相同HR基因 panel 中的 recurrent 拷贝数变化。该分析揭示了两个FOLFIRI敏感模型中RAD51旁系同源物RAD51B的纯合子缺失（GISTIC阈值-2）和一个FOLFIRI耐药模型中BRCA2位点的高水平基因扩增（GISTIC阈值+2）。在另外七个模型中检测到RAD54B解旋酶的高水平基因扩增，在三个模型中检测到核 foci 相关辅因子NBN，在一个模型中检测到RAD51相互作用子RAD52，但这些改变与FOLFIRI响应没有一致关联。在72个模型中鉴定出35个基因的半合子缺失（GISTIC阈值-1），再次与治疗结果无显著相关性。总体而言，分类为未知意义变异的突变 predominance、所分析基因广泛纯合子失活的罕见性以及突变或拷贝数改变与治疗响应之间缺乏强关联表明，FOLFIRI敏感性并非主要由HR基因失活驱动。尽管如此，轶事证据指出特定基因的改变，如影响RAD51B、BRCA2和TOP3A/TOP3B的改变，作为选定病例中响应的潜在决定因素。
作为附加分析层，我们调查了经受突变和拷贝数注释的HR基因 panel 在化学难治性和化学敏感性肿瘤之间是否表现差异甲基化和mRNA表达。两个类别之间的基线甲基化模式存在高度一致性，只有两个基因显示名义显著差异：DNA损伤传感器ATR（在响应者中甲基化程度更高）和DNA拓扑异构酶TOP3A（在非响应者中甲基化程度更高）。在基因表达水平，我们观察到耐药模型中DNA聚合酶δ复合物组分POLD3和BRCA1复合物伙伴ABRAXAS1的名义显著上调。相反，在耐药肿瘤中表达名义显著较低的基因包括TOP3A（与其较高甲基化一致）和DNA聚合酶δ复合物的催化亚基POLD1。
尽管POLD1不是敏感和耐药PDX模型之间差异表达的最高基因，我们选择进一步探索其与FOLFIRI响应的关联， prompted by 将低POLD1表达与乳腺癌化疗耐药相关联的先前证据。特别是，最近一项研究报告，在新辅助卡铂化疗后经历残留疾病的TNBC患者肿瘤中，位于19q13.31-33细胞带（包含POLD1）的基因产物表达减少。此外，具有POLD1单拷贝丢失和表达降低的克隆在PDX中随着肿瘤向卡铂耐药状态进展而扩展。与这些观察一致，我们发现POLD1蛋白丰度在FOLFIRI难治性mCRC PDX的基线肿瘤样本中显著低于响应模型，POLD1阳性强度与肿瘤响应程度显著相关。在治疗后（6周）样本中，POLD1蛋白水平普遍降低，在敏感肿瘤中减少更明显和一致。超过50%（8/15）显示POLD1单拷贝丢失的mCRC PDX被分类为FOLFIRI耐药；然而，近一半（32/69）具有正常POLD1拷贝数的模型也表现不良响应。这表明POLD1半合子丢失 alone 不能完全解释其在FOLFIRI耐药mCRC肿瘤中的表达降低，而转录和转录后调控可能发挥更重要作用。最后，对癌症依赖图项目药物筛选结果的调查显示，在泛癌细胞系集合中，低POLD1基因和蛋白表达与伊立替康敏感性降低显著相关，进一步证实了该关联的稳健性并可能将其范围扩展到其他肿瘤类型。这些发现强调了FOLFIRI耐药mCRC与卡铂耐药TNBC之间的共性，与我们与治疗响应相关的转录特征分析一致。
Genomic Scars of HR Deficiency
日益增长的知识表明，BRCAness通过评估HRD引起的基因组瘢痕比仅关注HR基因中的个体突变更能准确捕获，后者除了BRCA1和BRCA2外是罕见的且通常涉及不确定的功能效应。这一证据促使我们探索FOLFIRI敏感肿瘤是否显示BRCAness的基因组特征，即使在没有HR基因明确致病性改变的情况下。特别是，我们确定了参考子集PDX模型中由杂合性丢失、端粒等位基因失衡和大规模状态转换（HRD肿瘤中最相关的基因组瘢痕）产生的基因组不稳定性水平。两个处于临床开发中的基于NGS的研究 assay（AmoyDX HRD Focus和Illumina TruSight Oncology 500 HRD）的结果显示，响应者中的HRD得分显著高于非响应者，尽管两种 assay 采用不同的湿法方法和计算算法，但分析一致性非常高。
RAD51 Expression as a Biomarker of FOLFIRI Response
先前的结果表明，FOLFIRI敏感PDX模型表现出BRCAness表型，然而，这并非由HR通路基因功能丧失突变、缺失或启动子超甲基化驱动。DNA重组酶RAD51是HR通路的核心催化剂。特别地，RAD51加载到由核酸降解切除的DSB位点的单链DNA tract上，形成核蛋白 filament，介导链入侵以启动HR修复。最近的工作表明，低核丰度或核 foci 计数的RAD51预测在携带BRCA1/BRCA2野生型状态或亚阈值基因组瘢痕HRD得分的乳腺癌和卵巢癌患者中，铂类化疗或PARP抑制剂的临床获益。这表明低RAD51表达可能作为HR缺陷肿瘤的标志物，无论损害HR功能的潜在机制如何。鉴于此，我们通过IHC评估了参考子集PDX模型中RAD51的蛋白量。该分析揭示了响应者和非响应者之间RAD51阳性的显著差异。在基线（未治疗）条件下，耐药肿瘤中的核RAD51强度显著高于敏感肿瘤。类似地，在治疗后样本中，RAD51核蛋白 filament（显微镜下可视化为核 foci）的形成在FOLFIRI进展的肿瘤中比回归肿瘤更明显。基线和治疗后RAD51核阳性均与肿瘤化学敏感性程度显著负相关，表明较高的RAD51表达通常与 greater 耐药相关。尽管一些个体模型偏离此趋势，整体模式支持RAD51作为我们PDX队列中FOLFIRI耐药的关键预测因子。一致地，尽管存在个体变异性，RAD51在源自FOLFIRI耐药PDX的肿瘤核提取物中平均比源自FOLFIRI敏感PDX的更丰富。
这一证据表明，具有显著RAD51丰度的肿瘤通过有效调动细胞DSB修复机制而“准备就绪”以承受FOLFIRI的基因毒性影响。与该假设一致，在来自FOLFIRI敏感MSS PDX的类器官模型中，人RAD51的外源性稳定过表达导致基因组瘢痕HRD得分降低，并预防或减弱伊立替康活性代谢物SN-38治疗后的DNA DSB形成。在异位引入RAD51后DSB修复能力的这种增强导致对SN-38的敏感性降低。总的来说，这些发现表明高RAD51核阳性与——并因果支持——FOLFIRI耐药相关，通过促进抵消化疗DNA损伤效应的DSB修复熟练状态。
响应者和非响应者之间RAD51的差异表达在蛋白水平明显但在转录水平不显著，无论是在基线还是治疗后肿瘤中。为探索两个响应类别中RAD51的潜在翻译后调控，我们分析了一组已知直接或间接影响RAD51蛋白稳定性的泛素连接酶、去泛素化酶和解旋酶的mRNA表达。在这些调节因子中，泛素连接酶基因RING1和FBXO18因在FOLFIRI敏感PDX模型中表达显著更高而突出，表明它们可能参与降低响应肿瘤中的RAD51蛋白丰度。该差异表达模式通过参考子集PDX中的IHC分析得到进一步验证。
为评估RING1依赖性调控RAD51蛋白水平，我们检查了用MG132处理以抑制蛋白酶体依赖性降解的、瞬时转染RING1慢病毒载体的293T细胞中RAD51的泛化状态。该分析显示在RING1过表达细胞中高阶泛素化RAD51物种积累，支持RING1在靶向RAD51进行泛素介导的蛋白酶体降解中的作用。一致地，在类器官模型中，蛋白酶体抑制增加了RAD51蛋白稳定性。此外，尽管强制RING1过表达提高了RAD51稳态水平——可能由于慢病毒转导后的急性补偿机制——它在放线菌酮诱导的蛋白质合成抑制后缩短了RAD51半衰期。我们无法确定此调控是否也适用于FBXO18，因为类器官证明对其慢病毒转导有抗性。总体而言，这些发现表明RAD51的蛋白质稳态调控可能有助于在具有不同FOLFIRI响应的结直肠肿瘤中观察到的差异蛋白表达。
Clinical Validation of FOLFIRI Response Biomarkers
为在临床环境中验证RAD51和POLD1作为FOLFIRI响应的预测生物标志物，我们进行了IRInotecan敏感性（IRIS）研究，一项现实世界、回顾性、多中心研究，涉及82名mCRC患者，这些患者对一线或后线FOLFIRI为基础治疗有注释响应。在该队列中，通过盲法、集中化IHC评估患者原发肿瘤福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）
