随着岁月的流逝，人体的各个器官系统都会悄然发生退行性变化，而作为人体造血工厂的骨髓，其内部微环境的衰老更是牵一发而动全身。造血干细胞（Hematopoietic stem cells, HSC）坐落于一个被称为“龛”的特殊骨髓微环境中，这个由造血细胞与非造血细胞、细胞外基质和可溶性因子构成的精密网络，共同维系着正常的造血功能。然而，衰老不仅导致HSC数量增加却自我更新能力和再生潜能下降，更使得其赖以生存的微环境发生了剧烈重塑。过去几十年，虽然小鼠模型研究揭示了骨髓非造血微环境在衰老过程中的诸多改变，例如内皮细胞减少、血管结构紊乱、血管生成潜力下降以及间充质基质细胞分化能力受损等，但由于样本获取困难和技术方法的局限，将这些发现直接转化到人类身上一直面临巨大挑战。人类骨髓微环境在衰老过程中的具体分子变化，特别是内皮细胞和间充质基质细胞这两个关键组分的具体转录重塑规律，长期以来仍是一片未被充分探索的盲区。为了填补这一空白，全面解析衰老对人骨髓微环境的影响，来自西班牙纳瓦拉大学等机构的研究团队开展了一项深入细致的研究，相关成果发表在了衰老领域的权威期刊《Aging Cell》上。
为了回答上述问题，研究人员开展了一项针对健康年轻与老年个体骨髓组织的单细胞分辨率研究。他们利用荧光激活细胞分选技术从接受骨科手术的患者骨髓样本中分离出内皮细胞和间充质基质细胞，随后进行了单细胞RNA测序（scRNA-seq）。此外，还结合了免疫荧光染色和10× Genomics Visium空间转录组技术，从转录组和空间分布两个层面揭示了衰老相关的细胞变化。样本队列来源于纳瓦拉大学医院和图德拉雷纳索菲亚医院的骨科手术患者，年轻组年龄为28至48岁，老年组为58至79岁，所有样本均获得了伦理委员会批准和受试者的书面知情同意。
2.1 Transcriptional Profiling of Human Young and Aged BM Endothelial and Stromal Cells
研究人员首先对分选后的细胞进行单细胞转录组测序，经过质量控制后共获得35368个细胞，其中包括14283个来自年轻个体的细胞和21085个来自年老个体的细胞。尽管采用了特定的分选策略，样本中仍包含了部分污染的造血细胞。通过经典标记基因的表达，研究团队成功注释出内皮细胞（EC，表达CD9、PECAM1、VWF、CDH5和KDR）和间充质基质细胞（MSC，表达CXCL12、LEPR、PDGFRA、COL1A1和COL1A2）以及多种造血细胞亚群。进一步聚焦于EC和MSC的分析显示，最终数据集包含2163个EC（549个年轻，1614个年老）和5470个基质细胞（808个年轻，4662个年老）。这一结果证明了利用骨科手术来源的骨髓组织成功分离和分析人类低丰度骨髓EC和MSC转录特征的可行性。
2.2 Aging Is Associated With a Pro-Inflammatory Program in EC and the Emergence of RAB13+Cells
在对EC的深入分析中发现，除了已报道的动脉和窦状血管外，人类骨髓中还存在着先前未被描述的毛细血管和静脉血管床。衰老导致了EC亚群组成的显著改变：窦状EC显著减少，而静脉EC和一种新型动脉样EC亚群——RAB13+细胞显著增加。静脉EC高表达与抗原加工呈递及白细胞活化相关的基因，提示衰老过程中免疫反应失衡和促炎反应增强，其中SELE作为促血栓性内皮激活的关键驱动因子，在老年静脉EC中高表达，可能成为EC衰老的潜在生物标志物。值得注意的是，RAB13+EC表现出与动脉细胞相似的转录特征，但其特征是核糖体生物发生、mRNA稳定性和翻译相关基因（如HNRNPA1、YBX1和NPM1）的表达上调，并且富集了Myc靶点和细胞衰老相关基因集。调控网络分析表明，转录因子ZEB1可能是该亚群的潜在调控因子。免疫荧光染色证实了RAB13+CD31+EC主要定位于动脉周围区域，且与α-SMA1+细胞邻近，同时老年EC中pS6和ZEB1的表达增加，与转录组数据一致。
2.3 Aged Sinusoids Exhibited Mitochondrial Dysfunction and Impaired Vascular Functions
衰老不仅改变了EC的组成，更深刻影响了其功能。窦状EC在衰老过程中表现出最显著的差异基因表达，呈现出明显的促血栓表型，包括ANXA2、VWF和PLAT等基因的上调。同时，这些细胞还高表达参与细胞骨架动力学和细胞外基质相互作用的VIM、GSN和ANXA5，提示细胞外基质重排。线粒体功能和细胞解毒相关基因（如ATP5MC2、ATP5F1E、UQCR11、COX4I1等）的上调反映了细胞呼吸功能的衰老相关障碍。相反，细胞增殖和EC迁移调节基因的下调可能与老年骨髓血管通透性增加和渗漏有关。此外，溶质载体（如SLC2A3、SLC25A37、SLC8A1）的下调表明EC处理铁和钙的能力下降，可能导致非有机化合物积累和细胞损伤。调控子分析揭示了窦状EC中CEBPB、HES1、HMBOX1、TGIF2和NR5A2等转录因子活性的普遍下降。
2.4 THY1+-Fibro MSC and Matrix Remodeling Are Key Factors During BM Stromal Aging
在基质细胞研究中，除了未分化的MSC、成骨谱系（OLN）细胞和周细胞外，研究人员鉴定出一个高表达LGALS1、THY1、TIMP1和SPARC的细胞群体，将其命名为THY1+成纤维-MSC（THY1+Fibro-MSC）。与年轻样本相比，所有老年样本中均检测到了这一亚群，表明其在衰老骨髓中出现。该细胞群高表达FN1、MIF、S100A6、ANXA2以及胶原蛋白基因COL1A1、COL3A1和COL1A2，功能富集分析显示其参与成纤维细胞增殖、细胞外基质组织和上皮-间质转化（EMT）通路，提示其具有促纤维化特性。免疫荧光染色证实了老年骨髓中CD90+（THY1）PRRX1+MSC的比例增加，并且这些细胞参与了细胞外基质重塑、纤维化和TGF-β信号传导。更重要的是，在骨髓纤维化患者的活检样本中，也观察到了THY1+MSC在瘢痕组织区域的扩增，暗示该细胞群可能在年龄相关的纤维化疾病中发挥重要作用。
2.5 Impaired Differentiation and Oxidative Metabolism in Aged MSC
衰老对MSC的转录组产生了广泛影响，未分化MSC中检测到的差异表达基因数量最多。衰老MSC中下调的基因主要与骨化过程相关，提示年龄相关的骨质流失可能源于分化早期的缺陷。同时，调节造血和细胞分化的基因（如MEIS2、GAS6、SMAD7和ID2）以及热休克蛋白和参与蛋白质折叠的基因表达下降。另一方面，衰老MSC表现出氧化磷酸化（OXPHOS）和ATP代谢相关基因（如GSTP1、ATP5F1E、COX7C等）的表达上调，暗示线粒体代谢异常和活性氧水平升高。此外，脂肪生成基因、细胞外基质组织和重塑相关基因表达增加，基因集富集分析（GSEA）也证实了EMT、OXPHOS和脂肪生成的富集，而金属蛋白酶ADAMTS9和ADAMTSL3的下调进一步表明了细胞外基质重塑在骨髓基质衰老中的作用。
2.6 Age-Related Remodeling of EC-MSC Communication
细胞间通讯分析揭示了衰老导致的EC与MSC之间相互作用的重塑。在年轻骨髓中，Notch配体DLL4与NOTCH1-4的相互作用在衰老EC中被JAG1所取代，同时VEGFA介导的相互作用在衰老时被VEGFB主导，这些变化可能损害了血管形成能力。此外，年轻基质中存在的GDF7和骨形态发生蛋白（BMP）元件的相互作用在衰老细胞中消失，而载脂蛋白相关相互作用的增加则反映了衰老骨髓中脂肪生成表型的增强。在RAB13+EC与THY1+Fibro-MSC之间的特异性配体-受体对中，SLIT2-ROBO4、SLIT3-ROBO4和SFRP1-FZD6仅在老年个体中被识别，且THY1+Fibro-MSC通过SDC2受体与EC和MSC亚群表现出广泛的串扰，强调了细胞粘附和细胞外基质过程在衰老骨髓微环境中的重要性。
2.7 Impact of Aging on the BM Microenvironment Interactome
将分析扩展到整个骨髓微环境后发现，衰老增强了与树突状细胞（DC）的相互作用，这可能与老年人常见的慢性炎症有关。FN1作为潜在的相互作用配体，主要由EC、MSC和DC表达，并与整合素家族成员相互作用，进一步证实了细胞外基质重塑在骨髓衰老中的作用。TGFB1介导的相互作用在衰老EC和MSC中也显著增加，可能促进年龄相关的纤维化。此外，炎症细胞因子信号传导增强，CXCL12、ACKR1与CXCL和CCL趋化因子家族成员之间的相互作用在衰老时发生改变，MIF、CD74和CD99相关的配体-受体相互作用也增加了，共同构成了衰老骨髓的促炎微环境。
2.8 Spatial Transcriptomics Supports Age-Associated Vascular Changes
为了在空间层面验证上述发现，研究人员对年轻（34岁）和老年（76岁）个体的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）骨髓样本进行了空间转录组学分析。通过将单细胞图谱作为参考进行去卷积分析，成功识别了包含EC、MSC以及多种造血细胞的空间位点。空间分析显示，老年EC位点中RAB13相关特征评分更高，且YBX1的表达与RAB13+EC的空间模式共定位。同时，衰老EC位点中VIM和GSN的表达增加，BMPR2的表达降低，而FN1配体的表达升高，这些空间层面的发现有力地支持了单细胞测序的结果，证实了衰老相关的血管变化和细胞互作重塑。
综上所述，这项研究首次在人类生理衰老背景下，全面描绘了骨髓非造血微环境中皮细胞和间充质基质细胞的转录组、细胞间通讯及空间结构的重塑。研究不仅证实了衰老导致窦状EC出现促血栓表型和线粒体功能障碍，更创新性地发现了一种与翻译延伸活性和核糖体过程失调相关的新型动脉样EC亚群——RAB13+细胞，并揭示了其潜在的转录调控因子ZEB1。在基质细胞方面，研究明确了THY1+成纤维-MSC亚群在衰老骨髓中的出现及其促纤维化特性，该亚群的扩增伴随着细胞外基质重塑、EMT增强以及支持造血和成骨分化能力的下降。此外，研究还详细阐明了衰老过程中EC-MSC及其他骨髓细胞间通讯网络的紊乱，包括Notch、VEGF、BMP、FN1和TGF-β等关键信号通路的改变。通过整合单细胞测序与空间转录组技术，并结合免疫荧光验证，该研究为理解人类骨髓衰老的分子机制提供了前所未有的分辨率，所鉴定的RAB13+EC和THY1+Fibro-MSC及其相关通路，不仅为干预年龄相关性造血功能衰退提供了新的潜在靶点，也为骨髓纤维化等纤维化疾病的发病机制研究提供了重要线索。这些发现强调了非造血成分在塑造HSC功能轨迹和寿命中的关键作用，为开发靶向骨髓微环境以延缓衰老和治疗相关疾病的策略奠定了坚实的理论基础。
