在免疫系统中，巨噬细胞扮演着“哨兵”和“指挥官”的双重角色。当病原体入侵或组织受损时，它们会被激活，启动一系列复杂的防御程序。这个过程中，细胞的代谢状态会发生剧烈转变，从主要通过氧化磷酸化安静地产生能量，切换到更“激进”的糖酵解途径，以快速满足免疫反应的能量和生物合成需求。这种“代谢重编程”是巨噬细胞发挥免疫功能的基础。一氧化氮（NO）和衣康酸（itaconate）是这一过程中的两个关键代谢物和信号分子。
NO由诱导型一氧化氮合酶（iNOS）产生，是经典的炎症介质，具有广泛的生理和病理作用。而衣康酸则由三羧酸（TCA）循环中的顺乌头酸经免疫应答基因1（IRG1，也称为CAD或ACOD1）脱羧产生，是炎症反应中上调最显著的代谢物之一。衣康酸能通过共价修饰多种关键蛋白的 cysteine 残基，如调控炎症的ATF3、Jak1，参与糖酵解的GAPDH、LDHA等，从而调节巨噬细胞的极化状态，抑制促炎反应，并通过结构竞争性抑制琥珀酸脱氢酶来限制氧化应激。此前的研究发现，缺乏iNOS（iNOS-KO）的巨噬细胞在受到炎症刺激时，其细胞内衣康酸水平竟比野生型（WT）细胞高出约15倍。这强烈暗示iNOS和/或其产物NO是衣康酸产生的“刹车”。然而，这个“刹车”是如何工作的，是NO直接“毒害”了IRG1，还是另有隐情？这成了领域内一个待解之谜。
传统观点认为，iNOS的核心功能就是合成NO。但本研究挑战了这一认知，揭示了一个全新的、不依赖于NO产生的iNOS功能。研究人员发现，iNOS能够直接与IRG1在线粒体内结合，像一把“分子锁”一样抑制IRG1的活性，从而限制衣康酸的产生。这一相互作用依赖于iNOS的辅因子四氢生物蝶呤（BH4）来稳定其特定的蛋白质构象，但完全不需iNOS发挥其合成NO的酶活性。这一发现将iNOS置于一个连接氧化还原信号、代谢和炎症调控的信号枢纽中心，为理解免疫代谢调控提供了全新视角。相关研究成果发表在《自然-代谢》（Nature Metabolism）杂志。
为开展此项研究，作者主要运用了以下几类关键技术方法：利用基因敲除（iNOS-KO, Gch1-KO）和野生型小鼠的骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）构建炎症模型，进行代谢物（衣康酸、亚硝酸盐等）的定时检测与相关性分析；在缺乏内源性iNOS和IRG1的人胚肾（HEK）细胞中进行过表达、共转染及药物（iNOS抑制剂1400W、氨基胍，NO供体NOC18、SIN-1等）处理实验，以验证蛋白互作与功能；通过体外酶活实验，使用纯化的重组IRG1蛋白，检测其在不同氧化还原分子（NO供体、H2O2、谷胱甘肽等）存在下的活性；利用点突变技术构建IRG1所有cysteine突变体（C184A, C340A, C387A, C432A, C452A及五突变体ALA5）和iNOS的BH4结合位点突变体（W457A, W457F），以探究互作的关键位点；采用免疫共沉淀结合质谱分析（Co-IP/MS）鉴定WT与iNOS-KO巨噬细胞中IRG1的相互作用蛋白组，并利用STRING数据库进行互作网络分析；通过线粒体分离、免疫荧光共定位（使用Hsp60作为线粒体 marker）等技术确定iNOS与IRG1的亚细胞共定位；运用计算生物学方法，包括AlphaFold-Multimer进行小鼠和人源iNOS-IRG1异源四聚体结构预测，并进行分子动力学模拟以评估互作界面的稳定性，同时通过MM/GBSA方法计算结合自由能；采用表面等离子共振技术定量分析小鼠和人源iNOS与IRG1蛋白之间的结合动力学参数（KD， ka, kd）；利用蓝绿非变性凝胶电泳分析不同遗传背景（WT, Gch1-KO）及药物处理（氨基胍）下巨噬细胞中iNOS蛋白的单体/二聚体构象状态。研究还使用了人源系统进行验证，包括人单核细胞来源巨噬细胞和人诱导多能干细胞来源的骨髓类器官。
iNOS以NO非依赖性方式抑制IRG1活性与衣康酸积累
研究人员比较了野生型（WT）和iNOS敲除（iNOS-KO）小鼠骨髓来源巨噬细胞在LPS/IFNγ刺激不同时间点后的代谢与氧化还原状态。结果发现，刺激后期（6-30小时），WT细胞内衣康酸水平下降，而iNOS-KO细胞则持续积累衣康酸，18小时后细胞内水平相差超过15倍，细胞外衣康酸差异更大。这种抑制与亚硝酸盐（NO代谢产物）积累呈强负相关，但IRG1蛋白水平无变化。在HEK细胞中过表达IRG1可产生衣康酸，而共表达iNOS则完全抑制衣康酸产生，但NO产量不受影响。使用iNOS抑制剂氨基胍可完全恢复衣康酸生产，而另一种抑制剂1400W仅部分抑制NO却显著恢复衣康酸。多种NO供体（NOC18, SIN-1）则不影响衣康酸水平。这些结果表明，iNOS对IRG1的抑制与NO产量不完全同步，提示存在不依赖NO的机制。
iNOS衍生的活性分子不通过翻译后修饰直接抑制IRG1
为探究NO或相关活性分子（如H2O2）是否通过氧化还原修饰IRG1的cysteine残基来抑制其活性，研究人员建立了体外IRG1酶活检测体系。结果表明，多种NO供体、亚硝酸盐、过氧化氢、还原剂DTT等均不能抑制纯化IRG1的活性。尽管谷胱甘肽（GSH）与S-亚硝基谷胱甘肽（GSNO）共同处理降低了检测到的衣康酸信号，但这被证实是GSH直接与衣康酸形成加合物所致，而非抑制酶活。更重要的是，构建IRG1所有单个cysteine突变体及五突变体（ALA5）后，其在HEK细胞中产生的衣康酸水平与野生型IRG1相当，且依然能被共表达的iNOS完全抑制。这证明iNOS对IRG1的抑制不依赖于对其cysteine残基的翻译后修饰。
iNOS与IRG1在线粒体内发生直接蛋白质-蛋白质相互作用
为了寻找iNOS抑制IRG1的其他机制，研究人员对LPS/IFNγ刺激的WT和iNOS-KO巨噬细胞进行了IRG1的免疫共沉淀-质谱分析。结果显示，在WT细胞中，iNOS是IRG1最主要的结合蛋白之一，而在iNOS-KO细胞中则没有检测到。STRING分析也支持了WT中IRG1互作蛋白（包括iNOS及其他线粒体蛋白）之间的已知或预测相互作用。进一步的Co-IP实验证实，在缺乏NO产生的Gch1-KO巨噬细胞或用氨基胍处理的WT巨噬细胞中，iNOS依然能与IRG1共沉淀，表明iNOS的催化活性并非其与IRG1结合所必需。亚细胞定位分析发现，在激活的巨噬细胞中，iNOS与IRG1共同定位于线粒体。
计算模拟与生物物理实验证实iNOS-IRG1直接互作在人与小鼠中均保守
利用AlphaFold-Multimer对小鼠和人的（IRG1）2-（iNOS）2异源四聚体进行结构预测，结果显示二者可形成明确的互作界面，且两个二聚体呈近似垂直取向。分子动力学模拟表明该互作界面在300 ns内保持稳定。结合自由能计算也支持二者在溶液中直接结合。表面等离子共振实验定量证实，小鼠和人的iNOS与IRG1之间均存在高亲和力结合（KD值分别为~174 nM和~189 nM），且该作用具有特异性，内皮型NOS（eNOS）不与IRG1结合。
BH4稳定iNOS特定构象是其抑制IRG1所必需，但与l-精氨酸及NO产生无关
为了阐明iNOS抑制IRG1的分子细节，研究人员聚焦于其辅因子BH4。他们构建了iNOS的BH4结合位点突变体W457A（完全破坏BH4结合，无NO产生）和W457F（部分保留BH4结合，产生~50% NO）。在HEK细胞中共表达IRG1与这些突变体发现，尽管W457F仍能产生NO，但两种突变体均无法抑制衣康酸的产生，说明BH4结合对于iNOS抑制IRG1至关重要。进一步的体外实验表明，即使在缺乏其底物l-精氨酸及其他辅因子（NADPH, FAD, FMN）的情况下，具有活性的纯化iNOS蛋白（已结合BH4）仍能以剂量依赖的方式直接抑制纯化IRG1的酶活性，而热变性的iNOS则无此作用。这表明iNOS无需处于催化循环中即可抑制IRG1。蓝绿非变性凝胶电泳显示，在WT巨噬细胞中iNOS主要以二聚体形式存在；在缺乏BH4的Gch1-KO细胞中，单体比例增加；而在用氨基胍处理的WT细胞中，iNOS几乎完全呈二聚体。氨基胍通过形成iNOS-BH4加合物，将iNOS“锁定”在二聚体构象，这或许解释了为何它能恢复衣康酸产生：它可能阻止了iNOS形成抑制IRG1所需的特定动态构象。
研究结论与意义
本研究系统揭示了一条全新的免疫代谢调控轴。其核心结论是：诱导型一氧化氮合酶（iNOS）能以不依赖其一氧化氮（NO）合成活性的方式，通过直接与免疫应答基因1（IRG1）在线粒体内发生蛋白质-蛋白质相互作用，来抑制衣康酸（itaconate）的产生。这一相互作用依赖于iNOS辅因子四氢生物蝶呤（BH4）稳定其特定的蛋白质构象，但完全不需要其底物l-精氨酸及后续的NO生成。
这项研究的突破性意义在于多方面。首先，它打破了iNOS功能等同于NO合成的传统范式，揭示其作为一种“支架蛋白”或“调节蛋白”的非经典功能，将其置于连接氧化还原信号、细胞代谢和炎症调控的核心枢纽位置。其次，它阐明了炎症反应中iNOS与衣康酸两大关键分子之间的直接对话机制，解决了之前观察到的iNOS缺失导致衣康酸暴增的谜题。第三，研究提出了一个精妙的构象调控模型：BH4的结合使iNOS形成某种动态二聚体构象，从而获得与IRG1结合并抑制其活性的能力；而氨基胍等抑制剂可能通过改变这一构象，在抑制NO产生的同时“意外”地破坏了其抑制IRG1的功能。
从转化医学角度看，这项发现为靶向炎症性疾病提供了新的潜在策略。iNOS–IRG1–衣康酸轴成为一个全新的治疗靶标。未来或可设计小分子或肽类抑制剂，特异性破坏iNOS-IRG1的相互作用界面，从而在局部释放衣康酸的抗炎活性，而不影响iNOS的其他功能或全身性NO水平。此外，研究也提示，在缺乏iNOS的情况下，IRG1会与更多糖酵解、氧化还原和免疫相关蛋白互作，意味着iNOS可能通过“隔离”IRG1来间接调控更广泛的免疫代谢网络。这为进一步理解巨噬细胞功能可塑性和开发免疫代谢疗法开辟了新的道路。
