在癌症治疗的漫长探索中，p53一直是一个令人又爱又恨的靶点。作为人体最重要的抑癌基因之一，TP53的失活在超过一半的人类肿瘤中都能见到，它就像细胞内的“基因组守护者”，一旦功能失常，癌细胞便可能肆意生长。然而，这个靶点却长期被称为“不可成药”的典范——毕竟，恢复一个失去功能的抑癌蛋白的活性，远比抑制一个过度活跃的致癌蛋白要难得多。直到科学家发现了一个特殊的突变位点：Y220C。这个位于p53蛋白DNA结合域的突变，竟然会在蛋白质表面创造出一个野生型蛋白所没有的“隐秘口袋”。这个口袋就像一把锁，而科学家们成功设计出了能够精准插入这把锁的小分子钥匙——p53 Y220C再激活剂。其中，rezatapopt（PC14586）作为同类首个口服生物可利用的药物，在早期临床试验中已经展现出了令人鼓舞的疗效，为携带这一特定突变的癌症患者带来了新的希望。
然而，正如许多靶向药物都会面临的宿命，获得性耐药最终还是出现了。当肿瘤细胞再次对药物产生抵抗，病情发生进展时，背后的机制是什么？这是摆在临床医生和科学家面前的紧迫问题。为了回答这个问题，来自麻省总医院（MGH）和丹娜法伯癌症研究院（DFCI）的研究团队开展了一项深入的机制研究。他们聚焦于接受rezatapopt治疗的复发患者，通过对循环肿瘤DNA（ctDNA）、肿瘤活检组织以及尸检标本进行多组学分析，首次揭示了这一类革命性抗癌药物在临床上的耐药机制。这项重要的研究成果最终发表在了顶级期刊《Cancer Discovery》上。
为了解开耐药之谜，研究人员采用了多维度的技术手段。研究纳入了PYNNACLE临床试验（NCT04585750）中两位出现疾病进展的患者，收集了他们的基线及进展后的配对样本。关键技术包括：利用二代测序对肿瘤组织和血液ctDNA进行全外显子测序（WES）以追踪突变演化；采用液滴数字PCR（ddPCR）对系列ctDNA样本进行超高灵敏度的等位基因频率监测；构建稳转细胞系并在体外进行细胞活力检测以测定半数有效浓度（EC50）；运用实时荧光定量PCR（qPCR）分析p53下游靶基因的表达变化；以及通过染色质免疫共沉淀结合高通量测序（CUT&RUN）技术来评估突变体p53与染色质的结合能力。
Abstract
研究摘要指出，肿瘤抑制因子TP53是癌症中最常发生改变的基因，而Y220C热点突变在TP53突变肿瘤中占1.8%，该突变创造了一个可成药的空腔并导致p53不稳定。Rezatapopt作为首创的口服Y220C突变p53再激活剂，在1/2期PYNNACLE试验中显示了初步疗效。本研究报道了该类疗法首个临床耐药机制。通过对rezatapopt进展后的循环肿瘤DNA（ctDNA）、肿瘤活检及尸检标本的分析，发现了多种与Y220C处于顺式（cis）的异质性继发性TP53改变。这些改变主要分为两类：一是影响DNA结合域或导致移码/无义突变，从而消除转录活性；二是发生在Y220C结合表面的突变，预测会阻碍药物结合。功能建模证实这些双突变消除了rezatapopt对p53的再激活作用及靶基因诱导。这些发现确立了p53 Y220C再激活剂耐药的分子框架，并为克服耐药的新一代药物策略提供了依据。
Introduction
引言部分回顾了TP53失活突变在癌症中的普遍性及其作为治疗靶点的挑战性。重点介绍了Y220C突变形成的独特隐秘口袋，以及基于此设计的rezatapopt的临床进展。在PYNNACLE试验（数据截止2025年9月4日）中，112例患者的总体缓解率为34%，中位缓解持续时间为7.6个月。鉴于靶向治疗普遍面临耐药问题，本研究旨在通过对接受rezatapopt治疗患者的系列ctDNA评估，初步表征p53-Y220C再激活剂的临床获得性耐药机制。
Results
结果部分首先展示了两名患者的临床历程。患者1是一名58岁女性，患有HPV阴性头颈部鳞状细胞癌伴多发转移，在接受rezatapopt治疗后获得了部分缓解，持续约5个月后进展。进展时的ctDNA分析显示出现了多达94个TP53突变。患者2是一名65岁男性，患有输尿管鳞状细胞癌，治疗后临床症状改善，疾病稳定约6个月后出现肝转移。尸检及ctDNA分析显示出现了13个基线未检测到的TP53突变。系列ctDNA动态监测显示，Y220C TP53的等位基因频率最初下降，随肿瘤进展而急剧反弹，且伴随着新的TP53突变的出现。
随后，研究将这些获得性突变分为两类。第一类是损害p53功能的突变，包括作为“第二次打击”的失活点突变，以及导致非功能性蛋白产物的移码或无义突变。第二类则是发生在Y220C结合裂隙内的突变，这些突变本身可能不损害p53功能，但会改变rezatapopt的结合能力。
为了验证功能，研究人员在p53缺失的细胞模型中引入了代表性突变。体外实验表明，与仅表达Y220C单突变的细胞相比，表达Y220C与其他突变顺式组合的双突变细胞，其对rezatapopt的敏感性显著降低，IC50值增加了十倍以上。同时，双突变细胞无法在药物处理后上调p53靶基因（如p21、MDM2和PUMA）的表达。进一步研究发现，除移码突变导致蛋白丢失外，大多数二级突变并未影响Y220C突变蛋白的稳定性。
研究深入分析了第一类突变（如R175H, R248W, R273C, R282W），这些是经典的DNA结合域有害突变，即使药物能将p53恢复到野生型构象，它们也会阻止p53与DNA结合，从而导致对所有此类药物的普遍耐药。
对于第二类位于结合裂隙内的突变（影响F109, L145, V147, P151, P152残基），研究通过CUT&RUN等技术发现，虽然它们位于药物结合口袋，但并非都完全丧失p53功能。例如，V147L突变体仍能结合染色质并激活下游靶基因，显示出接近野生型的功能；而P152R则保留了部分结合能力但丧失了转录活性。这表明，像V147L这样的突变很可能是通过物理性地阻碍rezatapopt与Y220C裂隙的结合而导致耐药，而非仅仅因为灭活了p53。进一步的探索还发现，即便是同一个氨基酸位点（如P152），不同的氨基酸替换（如P152L vs P152R）也会导致不同的功能后果，但只要与Y220C共存，都会导致对rezatapopt的耐药。
Discussion
讨论部分强调，这是首个证明靶上继发性TP53突变可作为rezatapopt主要耐药机制的临床证据。研究确立了两类耐药机制：一类是通过DNA结合域突变或截短突变彻底消除p53转录活性，这类突变预计会对所有同类药物产生交叉耐药；另一类则是通过改变Y220C结合表面的空间结构来阻断药物结合，这类突变具有药物特异性，意味着换用不同空间结构或更高亲和力的下一代药物可能仍然有效。
这些发现具有重要的转化医学意义。对于由结合裂隙重塑引起的耐药，结构导向的药物设计和优化下一代Y220C再激活剂至关重要；而对于导致p53功能完全丧失的耐药，可能需要联合靶向DNA损伤反应或细胞周期调控等其他通路的疗法。未来的研究需要在更大的患者队列中验证这些耐药模式的流行率和演化规律，从而指导精准的临床决策。
综上所述，这项研究不仅首次描绘了p53 Y220C再激活剂rezatapopt的临床耐药图谱，还将耐药机制精细地划分为“功能丧失”和“结合阻断”两个层面。这不仅解释了为何患者会出现耐药，更为开发能够克服这些特定耐药机制的新一代药物提供了明确的分子蓝图，推动了等位基因特异性p53再激活这一新兴领域的临床发展。
