CRISPR筛选技术揭示卵巢癌中MYC启动子调控新机制：CYP4v2等四基因的发现与功能验证

为解决卵巢癌化疗耐药难题，日本研究人员通过改良CRISPR激活文库（SAM）结合启动子-报告系统（pMYC-promoter-Dendra2-Deletion），在OVSAHO细胞中筛选出ABI1、PCED1A、HOOK2和CYP4v2四个新型MYC启动子激活因子，双荧光素酶实验验证其调控活性超对照2倍以上，为靶向MYC转录调控的卵巢癌治疗提供新靶点。

卵巢癌作为致死率最高的妇科恶性肿瘤，其治疗面临两大核心挑战：高复发率和化疗耐药性。MYC作为关键原癌基因，在20%以上的高级别浆液性卵巢癌中存在扩增，且与顺铂耐药密切相关。然而由于MYC蛋白结构的复杂性，直接抑制剂开发长期受阻，迫使科学家转向寻找调控MYC转录的间接靶点。传统CRISPR筛选技术面临gRNA与靶启动子直接结合的干扰问题，亟需方法学创新。

日本东京科学研究所Morito Kurata团队在《Journal of Ovarian Research》发表研究，通过基因工程改造构建了删除MYC gRNA结合位点的pMYC-promoter-Dendra2-Deletion报告系统，结合CRISPR激活文库（SAM）和流式分选技术，在OVSAHO卵巢癌细胞中开展高通量筛选。研究采用Illumina NovaSeq 6000平台进行二代测序（NGS），通过cBioPortal数据库进行MYC与候选基因的mRNA表达相关性分析，最终通过双荧光素酶报告系统和基因过表达/敲降实验验证调控功能。

关键技术路线包括：1）构建删除260bp MYC转录起始区（含3个gRNA结合位点）的改良报告载体；2）在OVSAHO细胞中建立dCas9-VP64稳定表达体系；3）采用流式细胞术（FACS）分选Dendra2⁺细胞群体；4）基于TCGA数据库的Pearson相关性分析筛选候选基因；5）Western blot验证蛋白表达。

研究结果揭示：1）初筛获得86个reads≥1000的候选基因，其中14个（如CYP4V2、PCED1A等）与MYC表达显著正相关；2）双荧光素酶实验证实CYP4v2、ASPH等7个基因显著激活MYC启动子（p<0.05）；3）过表达实验显示ABI1、PCED1A、HOOK2和CYP4v2使启动子活性提升2倍以上；4）在OVTOKO细胞中观察到PCED1A/CYP4v2敲降导致MYC表达下降，提示细胞系特异性调控。

讨论部分指出：1）首次报道ABI1等四基因具有MYC转录激活功能，填补了MYC上游调控网络的空白；2）改良的CRISPR筛选系统有效规避了gRNA脱靶效应，为转录调控研究提供新工具；3）细胞系特异性结果提示需考虑肿瘤异质性，未来需扩大样本验证。该研究为开发靶向MYC转录调控的卵巢癌治疗策略奠定基础，其方法学创新对癌症表观遗传学研究具有广泛借鉴意义。