LI-COR DNA分析系统在RIKEN小鼠基因百科全书计划和高粱基因组计划中大显身手[创新技巧]

The RIKEN Genome Exploration Research Group Phase II Team and the FANTOM Consortium, Functional annotation of a full-length mouse cDNA collection, Nature 2001, 409: 685-690

    RIKEN小鼠基因百科全书计划 (The RIKEN Mouse Gene Encyclopaedia Project) 是系统地确定小鼠基因组全部全长编码序列的计划,该计划包括全长cDNA的整理和测序以及相应基因的基因组物理图谱的构建.在这篇Nature Article中,作者宣布了首批21076个cDNA的分析.这是迄今为止所有生物的类似研究中规模*大的描述之一.这项计划集中了44个科研单位的96名科学家,涉及美国,日本,英国,意大利,德国和澳大利亚等六国.另外还有一百多名科技工作者参与讨论,鼓励和技术帮助.

    这些序列的平均长度为1257bp,*长为6327bp.用PHRED base-calling program评估测序结果,平均精确度为99.1%.占总克隆数72%的其中15236个克隆的精确度大于99%,占总数32%的6739个克隆的精确度大于99.9%.

    这其中,小于2500bp的cNDA (至少15136个cDNA)是用Li-COR DNA 4200测序仪器进行分析的.15136个cDNA中的2834个较长序列的*中间序列(远离5’和3’端的序列)是用ABI Prism377 /ABI Prism3700测定的.

    大于2500bp的cDNA (至少1661个cDNA) 先做亚克隆,继而用Shimadzu RISA 384 (RIKEN Integrated Sequence Analysis)测序.

    下图说明,小于2500bp的克隆子占了绝大部分 (大于15136个序列),也就是说绝大部分cDNA的测序是用LI-COR仪器进行的.

Distribution of the length of 21,076 insert DNAs

    高粱具有很多在农业上很重要的性状.构建高粱基因组 (750Mbp) 的完整的遗传和物理图谱是高粱基因组计划的主要目标 (Patricia E. Klein et al, Genome Research 2000, 10 (6): 789-807). 这个计划涉及汇集高粱的6个不同文库的24576个BAC克隆而产生184个BAC DNA集合.每个集合的DNA片段利用AFLP技术进行扩增,然后在LI-COR 4200L-2型双色自动DNA序列分析系统进行分离,*后用相关软件进行分析.结果,每套引物平均产生28个单拷贝的DNA标记.利用产生的单拷贝的DNA标记来鉴定BAC克隆重叠.利用32种引物的不同组合共鉴定了2400个BAC.作者也用LI-COR系统进行了SSR. 作者认为,与其他分子标记方法 (如SSR和STR) 相比,利用AFLP并结合LI-COR系统的优点在于敏感,有效和费用合理,以及真实图像.

    在克隆Hermansky-Pudlak综合症 (Hermansky-Pudlak syndrome) 新基因的研究中,研究者利用LI-COR系统进行了微卫星分析 (Yair Anikster et al, Nature Genetics 2001, 28: 376 – 380).

    LI-COR推出的DNA分析系统利用红外荧光染料而非可见光荧光染料标记DNA,并且利用固态激光器 (寿命4-6万小时,保修5年, 0.03-0.05美元/小时折旧费用,两种特定波长的红外荧光染料分别用特定波长的激光器和检测器激发和检测) 而非氩离子激光器.由于玻璃板,胶及生物大分子在红外波长处没有背景荧光,所以灵敏度很高,可以检测少至15amoles的标记DNA.独特的设计使该系统的单向测序能力*长可以达到1200bp以上,而独特的同时双向测序策略使2000bp的DNA片段从两端的测序反应在一个反应体系完成,并且有相关软件可以将序列比较和拼接.而且测序精确度很高.对2578个样品共计3Mbp的分析表明,每个样品单向测序能力平均为1124bp,总错误率只有1.73%. 另外,该系统结合*权威的软件 (Saga, Quantar等),使其成为基因型分析 (如AFLP, 微卫星分析等) 的领导者.LI-COR为DNA序列分析和基因型分析提供了从仪器,试剂到分析软件的完整解决技术平台.该系统还可为研究者提供真实凝胶电泳图像.因此利用LI-COR系统进行DNA序列分析和基因型分析的应用文献很多.

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