引言
在植物的免疫系统中，可诱导的植物防御机制是一个复杂而精妙的过程，涉及细胞表面和细胞内免疫受体引发的一系列反应协同作用。细胞表面的模式识别受体（PRRs）能敏锐地检测到胞外病原体相对保守的分子，如几丁质或鞭毛蛋白，进而启动模式触发免疫（PTI）；而细胞内的核苷酸结合富含亮氨酸重复受体（NLRs）在识别特定病原体效应蛋白后，会激活效应子触发免疫（ETI）。ETI 和 PTI 相互配合，共同为植物抵御病原体的侵袭构建起一道坚固的防线。
近年来，关于 Toll / 白细胞介素 - 1 受体 / 抗性蛋白（TIR）型 NLR（TNL）触发的 ETI 下游信号通路的研究取得了显著进展。研究发现，EDS1（ENHANCED DISEASE SUSCEPTIBILITY 1）、PAD4（PHYTOALEXIN DEFICIENT 4）、SAG101（SENESCENCE-ASSOCIATED GENE 101）等脂肪酶样蛋白，以及 ADR1（ACTIVATED DISEASE RESISTANCE 1）家族和 NRG1（N REQUIREMENT GENE 1）家族等辅助 NLR 蛋白，在这一过程中发挥着关键作用，它们都含有与抗白粉病 8（RPW8）类似的卷曲螺旋 N 端信号结构域。
在拟南芥及众多其他植物物种中，EDS1、PAD4 和 SAG101 已成为 TNL 信号的核心调节因子。这些蛋白通过形成不同的异二聚体复合物，精准调控细胞死亡和抗病性。例如，EDS1 - PAD4 复合物在局部和系统获得性抗性（SAR）中起着不可或缺的作用；而 EDS1 - SAG101 复合物则被认为在局部免疫反应，如限制植物病毒传播方面更为关键。此外，PAD4 和 SAG101 还能影响水杨酸（SA）的积累，将激素信号通路与细胞死亡和抗病性的调控紧密联系起来。
拟南芥中的 ADR1 家族蛋白包括 ADR1、ADR1 - LIKE 1（ADR - L1）和 ADR1 - L2，它们作为辅助 NLR 蛋白，在控制 ETI 过程中至关重要，能够放大信号，促进效应子识别后下游免疫反应的激活。NRG1 辅助 NLR 家族蛋白，如 NRG1A（或 NRG1.1）和 NRG1B（或 NRG1.2），对于 TIR - NLRs 驱动的超敏反应（HR）细胞死亡是必需的，并且有助于增强对卵菌病原体的抗病性。遗传学研究表明，pad4 突变体在经典免疫反应中表现类似于 adr1 突变体，而 sag101 突变体则类似于 nrg1 突变体，这进一步支持了 EDS1 - PAD4 与 ADR1s 协同限制细菌生长，EDS1 - SAG101 与 NRG1 协同促进 TNL 介导的细胞死亡的模型，暗示存在两个与 EDS1 相关的不同免疫调节节点，它们会引发不同的下游信号。
植物在应对病虫害时，会出现生长防御权衡的现象，即生长速度放缓，这是植物经济学中的一个重要原则，对生态系统和作物育种都有着深远影响。许多组成型 ETI 突变体，由于 NLR 的自动激活，在获得抗病能力的同时，也付出了严重的生长代价，这可能是通过多种激素信号通路实现的。此外，植物预先接触病原体或病原体衍生的配体，能够启动免疫，使其在后续遭遇病原体时产生更强烈的免疫反应。然而，目前对于关键免疫调节因子在 ETI 介导的生长防御权衡和免疫启动中的具体作用机制，仍知之甚少。
本研究旨在深入剖析 TNL 诱导的 ETI 下游由 EDS1 - PAD4 - ADR1s 和 EDS1 - SAG101 - NRG1s 介导的模块化信号通路，重点探究它们在细胞死亡、免疫启动和 ETI 诱导的生长停滞中的作用，并揭示 EDS1 - PAD4 和 EDS1 - SAG101 节点之间的差异转录结果。这一研究将推动对植物免疫的理解，为在不影响作物生长和产量的前提下提高抗病性提供潜在策略。
结果
EDS1 - PAD4 - ADR1s 和 EDS1 - SAG101 - NRG1s 在 ETI 诱导的生长停滞中的差异作用
以往对脂肪酶样 / 辅助 NLR 突变体的免疫表型研究，都是在 PTI 存在的情况下激活 ETI 时进行的，因此这些结果在多大程度上是 ETI 特异性的并不明确。在本研究中，研究人员利用 β - 雌二醇（E2）诱导表达 AvrRps4 的 “SETI” 品系，通过 RPS4 和 RRS1 以及 RPS4B 和 RRS1B 这两对 TIR - NLRs，在没有 PTI 的情况下激活 TNL 介导的 ETI。
当 SETI 植物在含有 E2 的培养基上生长时，出现了明显的生长停滞现象，植株的大小和鲜重都有所减少。而在 eds1 - 2 突变体（SETI_eds1）和 pad4 sag101 双突变体（SETI_ps）中，这种生长停滞完全被抑制，这表明 EDS1、PAD4 和 SAG101 在调节 TNL 介导的 ETI 诱导的生长抑制中起着关键作用。
有趣的是，sag101 单突变体（SETI_sag101）的生长抑制模式与野生型 SETI_wt 相似，这意味着 SAG101 对 ETI 诱导的生长停滞没有贡献。而 pad4 单突变体（SETI_pad4）在没有 PTI 的情况下，似乎部分抑制了 ETI 诱导的生长停滞，尽管 AvrRps4 的表达诱导水平相似，这表明 PAD4 在介导 ETI 依赖的生长停滞中可能发挥着独立于 SAG101 的重要作用。同时，研究还发现，SETI_wt 和 SETI_sag101 植株的侧根形成受到严重抑制，而在 SETI_pad4 植株中这种抑制得到部分缓解，在 SETI_eds1 和 SETI_ps 中则完全缓解，这进一步说明了 PAD4 在控制根生长和发育方面的作用。
与之平行的研究中，nrg1a nrg1b 双突变体（SETI_nrg1s）的表型与 SETI_sag101 相似，暗示 NRG1 家族蛋白可能对 ETI 引起的生长停滞没有贡献。最后，adr1 adr1 - l1 adr1 - l2 三突变体（SETI_adr1s）的表型与 SETI_pad4 相似，表明 PAD4 和 ADR1 蛋白在调节 ETI 介导的生长停滞方面存在功能相关性。
PAD4 - ADR1s 和 SAG101 - NRG1s 对 ETI 介导的细胞死亡的不同贡献
在没有 PTI 的情况下，SETI_wt 不会因 ETI 诱导而产生明显的宏观细胞死亡。通过记录 E2 诱导后的离子泄漏情况，可以检测到超敏反应（HR），在接种后 4 小时（hpi），这种离子泄漏与 mock 处理组有明显区别，并且在 22 hpi 达到饱和。SETI_eds1 和 SETI_ps 植株在 E2 处理后，离子电导率没有显著增加，这突出了 EDS1、PAD4 和 SAG101 在介导 ETI 介导的细胞死亡中的相互作用。
有意思的是，SETI_pad4 植株在 E2 诱导后离子电导率的增加与 SETI_wt 相似，这说明单独的 PAD4 不足以激活 ETI 诱导的细胞死亡。然而，SETI_sag101 植株在 E2 处理后，离子电导率的增加显著受损，这表明 SAG101 在没有 PTI 的情况下，独立于 PAD4 在介导 ETI 诱导的细胞死亡中发挥作用。此外，只有 SETI_ps 突变体能够像 SETI_eds1 一样完全抑制 ETI 诱导的离子泄漏，这表明 PAD4 和 SAG101 在细胞死亡过程中具有协同作用，只有当两者都缺失时，离子泄漏才会完全消失。在 SETI 背景下的辅助 NLR 突变体（SETI_nrg1s 和 SETI_adr1s）中也观察到了类似的趋势，SETI_adr1s 表现类似于 SETI_pad4，而 SETI_nrg1s 表现类似于 SETI_sag101，这表明 SAG101 - NRG1 节点可能对 ETI 诱导的细胞死亡贡献更大，而 PAD4 - ADR1 节点在平行的 SAG101 - NRG1 节点存在时，仅起到协同作用。
HR 与叶绿素分解代谢密切相关，因此研究人员检测了叶绿素含量，将其作为细胞死亡的另一个指标。结果发现，SETI_wt 和 SETI_pad4 植株在 E2 处理后，总叶绿素含量下降，在 “PTI + ETI” 处理（50 μM 的 E2 和 Pst DC3000 hrcC− ）后，这种下降更为显著。而 SETI_sag101 植株在 PTI + ETI 处理后，总叶绿素含量才有显著下降，单独的 PTI 或 ETI 处理则没有明显变化，且下降幅度不如 SETI_pad4 和 SETI_wt。正如预期的那样，SETI_ps 植株的叶绿素含量没有下降。SETI_adr1s 在 ETI 和 PTI + ETI 处理后，叶绿素含量也显著下降，而在 SETI_nrg1s 中这种下降得到缓解，这再次证实了 SAG101 - NRG1 节点对 ETI 诱导的细胞死亡贡献更大。
ETI 介导的免疫启动需要 PAD4 - ADR1s 和 SAG101 - NRG1s 节点
先前的研究表明，SETI_wt 植株用 E2 预处理后，对随后的细菌感染具有更强的抗性，这说明 ETI 单独就能启动植物免疫。本研究也观察到，当 SETI_wt 植株在接种携带空载体的致病细菌菌株 Pst DC3000 前 1 天用 E2 预浸润时，与 mock 对照相比，细菌生长显著减少。然而，用 E2 预处理的 SETI_eds1 和 SETI_ps 植株则完全丧失了免疫启动能力。
研究人员进一步对 SETI_pad4 和 SETI_sag101 突变体植株进行 E2 或 ETI 诱导的疾病启动试验。结果发现，用 E2 预处理的 SETI_sag101 植株在抗病启动方面与 SETI_wt 植株没有显著差异；SETI_pad4 植株虽然也保留了一定的启动效应，但用 E2 预处理后，其细菌生长量总体高于 SETI_wt 和 SETI_sag101 植株。值得注意的是，pad4 突变体在由细菌鞭毛蛋白的 22 个氨基酸表位引发的 PTI 启动的抗病性中部分受损，在 nlp20 诱导的启动中则完全受损，这表明 PAD4 在拟南芥中，对 ETI 和 PTI 启动的抗病性可能都比 SAG101 发挥更重要的作用，尽管两者对于 TNL 介导的 ETI 的疾病启动都是必需的。
研究人员还对 SETI_nrg1s、SETI_adr1s 突变体以及更高阶的 SETI_helperless 突变体（adr1 adr1 - l1 adr1 - l2 nrg1a nrg1b 五重突变体）进行了 ETI 介导的疾病启动测试。结果显示，用 E2 预处理的 SETI_nrg1s 在疾病启动方面没有明显缺陷，与 SETI_wt 和 SETI_sag101 相似；而 SETI_adr1s 的表型与 SETI_pad4 相似。只有用 E2 预处理的 SETI_helperless 植株完全丧失了疾病启动能力，结合 SETI_ps 的结果，可以推断 PAD4 - ADR1 和 SAG101 - NRG1 节点对于 TNL 激活的 ETI 介导的免疫启动都是必需的。
ETI 特异性防御基因谱分析
为了探究 SAG101 - NRG1s 和 PAD4 - ADR1s 节点在防御基因激活方面的差异和相似性，研究人员对 SETI 突变体系进行了全基因组 RNA 测序（RNA - seq），通过 E2 处理特异性诱导 ETI。研究发现，在所有测试的基因型和处理中，共有 5067 个差异表达基因（DEGs），这些基因的筛选标准为 p < 0.01 且 | log2 [fold change (FC)]| ≥ 1。与 mock 处理相比，SETI_wt 中有 1902 个上调基因，SETI_pad4 中有 1707 个上调基因，SETI_sag101 中有 2281 个上调基因。
与 SETI_wt 植物相比，SETI_pad4 突变体在 E2 处理后的 DEGs 数量显著减少，这表明 PAD4 在 TNL 介导的 ETI 诱导的转录重编程中起主要作用，其功能缺失无法被 SAG101 补偿。相反，SETI_sag101 突变体中的 DEGs 数量没有减少，反而比 SETI_wt 更多，这可能是由于功能性 PAD4 的过度补偿，或者是 PAD4 和 SAG101 之间存在未知的协同机制。SETI_sag101 突变体中 DEGs 的持续存在表明，在 ETI 早期激活过程中，SAG101 在抑制或调节这些基因表达方面可能不如 PAD4 关键。这两个突变体对基因表达的不同影响，凸显了 PAD4 和 SAG101 在植物免疫反应中的不同作用，也强调了 ETI 信号通路的复杂性。同时，这也体现了 PAD4 - ADR1s 和 SAG101 - NRG1s 之间的不等冗余性，与之前的报道一致，即 ADR1s 可以补偿 NRG1s，但反之则不行。在 SETI_eds1 和 SETI_pad4 sag101 突变体中，E2 处理后与 mock 相比没有 DEGs，这表明 eds1 突变体和 pad4 sag101 双突变体可以完全阻断 TNL 介导的 ETI 特异性转录重编程。
通过对 DEGs 进行层次聚类分析，研究人员利用欧几里得距离和 ward.D 聚类算法，将其分为 10 个簇。基因本体（GO）分析显示，簇 3、5、6、7、8 和 9 中的 DEGs 与防御相关，属于免疫相关簇。例如，簇 5 包含 N - 羟基哌啶酸（NHP）生物合成基因 FMO1 和 ALD1，簇 5 和 9 包含与细胞死亡相关的基因；簇 7 包含与 SA 生物合成和信号传导相关的基因，如 ICS1、EDS5 和 NPR1；簇 8 包含与茉莉酸信号传导相关的基因。研究人员还对簇 1、2、4 和 10 中的下调 DEGs 进行了分析，这些簇主要由 ETI 早期激活过程中下调的基因组成。GO 术语分析表明，这些簇中的大多数 GO 术语与激素反应、糖生物合成、糖代谢以及发育和光合途径相关，这表明 ETI 激活对植物的激素、细胞和代谢过程有显著的负面影响，这与早期研究结果一致。这种负面影响的持续存在可能是 SETI_wt 和 SETI_sag101 在 E2 平板上生长严重受阻的原因之一。研究人员还检查了选定 GO 术语中富集基因的表达谱，发现 SETI_wt 和 SETI_sag101 的下调模式非常相似，而 SETI_pad4 在大多数与碳水化合物代谢、植物形态发生和光合作用相关的基因中，下调程度较小，在激素途径基因（包括在侧根形成中起重要作用的生长素反应基因）方面也有类似趋势，这为解释 SETI_pad4 植株中生长停滞和侧根形成部分改善的现象提供了一些线索。
定义 PAD4 和 SAG101 介导的转录重编程的特异性
研究人员进一步将上调的 DEGs 分为 PAD4 依赖型、SAG101 依赖型和共享依赖型。共鉴定出 438 个 PAD4 依赖型 DEGs，这些基因在 SETI_wt 和 SETI_sag101 中上调，但在 SETI_pad4 中下调或无显著差异；85 个 SAG101 依赖型 DEGs，在 SETI_wt 和 SETI_pad4 中上调，但在 SETI_sag101 中下调或无显著差异；还有 121 个 DEGs 对 PAD4 和 SAG101 都有共享依赖性。此外，有 1258 个 DEGs 在 SETI_wt、SETI_pad4 和 SETI_sag101 中均上调，这表明这些 DEGs 的转录调控是 ETI 特异性的，但由 PAD4 和 SAG101 冗余调控。研究人员对这些基因进行了进一步分类，并对其进行 GO 术语分析，突出了与免疫相关的生物学功能。结果发现，PAD4 依赖型的 DEGs 数量比 SAG101 依赖型的更多，一些与 SAR 相关的基因，如 FMO1 和 ALD1，完全依赖于 PAD4，而其他一些基因则依赖于 PAD4 和 SAG101 两者。
从离子泄漏数据可以看出，SAG101 对细胞死亡的贡献更大，但 PAD4 除了调节细胞死亡外还具有协同作用。正如预期的那样，细胞死亡相关基因存在于所有类别中，包括 PAD4 特异性、SAG101 特异性和 PAD4/SAG101 共享型。例如，富集在细胞死亡相关 GO 术语中的基因，如 METACASPASE 2（MC2）、MC8、CYSTEINE - RICH RECEPTOR - LIKE KINASE 13（CRK13）和 BAX INHIBITOR 1（BI1），被发现依赖于 PAD4；<而像 lazarus 5（laz5）和 crk4 等基因则依赖于 sag101；bcl - 2 associated athanogene 6（bag6）和 membrane attack complex perforin - like 2（macp2）等基因则依赖于 pad4 和 sag101 两者。在下调的 degs 中也观察到类似的情况，一些 degs 是共享的，而另一些则由 pad4 或 sag101>
这些结果突出了 PAD4 和 SAG101 对转录重编程的冗余调节作用，表明虽然一些 DEGs 由一个节点独特控制，但很大一部分是由两者共同调节的，强调了它们在协调 ETI 反应中不平等的冗余作用。总体而言，与 SAG101 相比，PAD4 在调节 ETI 激活的转录重编程中似乎发挥着更突出的作用，这可能解释了为什么 PAD4 对 ETI 诱导的生长停滞和免疫启动贡献更多，而 SAG101 在细胞死亡中作用更显著。不过，目前仍不清楚这两个不平等冗余的节点如何在 TNL 介导的 ETI 下游实现转录调控的特异性。
讨论
在植物免疫反应中，当传感器 TNL 被激活后，EDS1 会与 PAD4 或 SAG101 这两种脂肪酶样蛋白中的一种相互作用，从而启动 ETI 下游信号通路。随后，辅助 NLR，即 ADR1 或 NRG1，会分别与 EDS1 - PAD4 和 EDS1 - SAG101 模块相互作用。ETI 能够促进 NRG1 与 EDS1/SAG101 的相互作用，但 NRG1/EDS1/SAG101 的寡聚化需要 PTI 的参与。已有研究表明，EDS1 - PAD4 - ADR1s 和 EDS1 - SAG101 - NRG1s 在植物免疫反应中发挥着不平等的冗余作用，EDS1/PAD4/ADR1s 对疾病抗性的贡献更大，而 EDS1/SAG101/NRG1s 在细胞死亡方面作用更突出。然而，对于它们发挥不平等作用的下游组件和分子机制，目前还了解得不够深入。
本研究聚焦于 PAD4 和 SAG101 节点在 ETI 中的特异性作用。研究人员利用可诱导 ETI 遗传背景下的 EDS1 家族蛋白和辅助 NLR 突变体，确定了这些蛋白在介导 ETI 特异性信号中的作用。与 SETI_sag101 相比，SETI_pad4 植株在 E2 平板上生长减少和侧根抑制的现象得到部分缓解，这表明 PAD4 在协调植物生长、发育和防御之间的平衡方面起着重要作用。SAG101 与 PAD4 在生长防御权衡中也存在协同作用，因为只有 SETI_ps 双突变体没有表现出生长抑制。尽管生长防御权衡的详细机制仍有待探索，但本研究关于 PAD4 和 SAG101 在介导 ETI 特异性生长抑制中的差异作用的报道，为揭示其潜在分子机制提供了新的信息。
免疫启动是指植物在接受启动处理后，抗病能力增强的现象。本研究发现，SETI_pad4（类似地，SETI_adr1s）和 SETI_sag101（类似地，SETI_nrg1s）在 ETI 激活后都表现出一定的免疫启动能力，尽管 pad4（或 adr1s 三突变体）和 sag101（或 nrg1s 双突变体）植株更易感染疾病。这表明部分免疫受损的植物仍然保留着抗病启动的能力。这一发现为改进农业实践提供了支持，例如对于那些能够部分逃避植物免疫监测系统或抑制免疫激活过程的新兴或再现病原体，可以测试 ETI 介导的免疫启动是否能增强作物的抗病性。本研究仅探索了这些突变体的短期启动能力，而免疫启动可能提供更长期的保护，因此研究这种免疫记忆的持续性以及植物细胞如何 “记忆” 或 “印记” 这种启动效应将是一个有趣的研究方向。
先前的研究表明，HR 和抗病机制可以独立运作。本研究进一步分析发现，SAG101 - NRG1s 模块主要促进 ETI 激活的细胞死亡，而 PAD4 - ADR1s 模块对于启动抗病性更为关键。尽管它们具有特异性，但在调节 HR 和抗性方面，两个模块存在重叠功能，不过这种重叠是部分冗余的。具体来说，NRG1s 对于 TNL 介导的对专性生物营养卵菌病原体（如霜霉病菌 Hyaloperonospora arabidopsidis 和白锈病菌 Albugo candida）的抗病性是必需的；ADR1s 也参与了 TNL 介导的对 Hpa 的抗性。sag101 单突变体仅表现出孤立的单细胞 HR 细胞死亡，其易感性比 nrg1a nrg1b 双突变体轻，但在多个实例中，SAG101 和 NRG1s 都被认为是 EDS1 介导的同一下游信号通路的一部分。pad4 单突变体能够产生分生孢子并伴有单细胞拖尾坏死，这与 adr1s 三突变体的现象一致。更有趣的是，SAG101 和 NRG1s 对于抵抗半生物营养细菌病原体 P. syringae 似乎是可有可无的，在这种情况下，PAD4 - ADR1s 节点发挥着更重要的作用。因此，未来的研究需要全面评估一系列突变体的抗病性，包括携带脂肪酶样蛋白编码基因突变（pad4、sag101 及其双突变体）的突变体，以及影响辅助 NLR 编码基因（nrg1s、adr1s 及其五重突变体 helperless）的突变体，并测试它们对更多不同类型植物病原体的反应。此外，深入研究每个节点如何调节对 HR 和抗性的功能偏好，以及这些与 ETI 诱导的生长抑制和疾病启动的差异表型之间的联系，将有助于深入了解 NLR 介导的免疫有效性，探索 SAG101 - NRG1s 和 PAD4 - ADR1s 节点的协同效应是如何实现的。
值得注意的是，在植物与微生物的真实相互作用中，ETI 总是在 PTI 之后发生，这使得研究 ETI 特异性反应变得具有挑战性。例如，在包含所有处理（PTI、ETI 和 PTI + ETI）的热图中，PTI + ETI 处理下不同脂肪酶样突变体的基因表达模式与仅 ETI 处理相比，区分度要低得多。研究人员推测，PTI 可能通过预先激活一组与 ETI 诱导的防御相关通路重叠的通路，从而掩盖了整体的 ETI 转录组。具体来说，PTI 诱导的基因可能会使细胞反应机制饱和，进而减弱或掩盖后续 ETI 特异性基因的激活。这一推测得到了以下观察结果的支持：在 SETI_wt 中，通过对所有条件（PTI、ETI 和 PTI + ETI）下的 DEGs 分析发现，ETI 激活了一组在 PTI + ETI 联合处理中未显示的独特基因；并且与单独的 ETI 处理相比，PTI + ETI 处理中上调基因的数量显著减少，这表明 PTI 处理可能导致特定基因的表达达到阈值，使得后续对 ETI 的反应不那么明显，这种掩盖效应可能解释了为什么在热图中 PTI 和 PTI + ETI 的表达谱相似。此外，选择接种后 4 小时（hpi）这个时间点进行研究可能也对结果产生了影响，这个时间点对于捕捉早期 PTI 反应来说相对较晚，但仍处于 ETI 下游效应能够显现的窗口内，在这个阶段，一些通常与 ETI 相关的反应可能与 PTI 协同作用，尤其是因为所使用的细菌具有功能性的 III 型分泌系统。在一些近期的报道中也发现了类似的效应。TNLs 或 TIR - 仅蛋白具有酶活性，能够产生与不同 EDS1 复合物（与 PAD4 - ADR1s 或 SAG101 - NRG1s 结合）相关的小分子。本研究针对 PAD4 - ADR1s 或 SAG101 - NRG1s 模块的 ETI 特异性转录组分析结果，可能为深入理解这一过程提供更多见解。由于 EDS1 - SAG101 - NRG1s 辅助 NLR 抗性小体的形成需要细胞表面免疫受体介导的 PTI，因此比较 SETI_pad4 中 PTI、ETI 和 PTI + ETI 的基因表达模式将是一个有趣的研究方向。此外，还有一些重要问题尚未解决，例如 NRG1s 和 ADR1s 形成的抗性小体如何激活 ETI 下游反应？NRG1s 和 ADR1s 的阳离子通道活性是否足以激活观察到的转录重编程？
从更广泛的角度来看，不同植物物种中的 PAD4 和 SAG101 在 TNL 介导的 ETI 激活过程中可能具有不同的功能。例如，茄科植物基因组主要编码两种 SAG101 异构体（SAG101a 和 SAG101b），在本氏烟草（Nicotiana benthamiana）中，EDS1 - SAG101b 在几乎所有 TNL 介导的 ETI 免疫反应中都起着至关重要且充分的作用，而本氏烟草中的 PAD4 则没有表现出明显的作用。然而，与本氏烟草的 SAG101s 类似，本氏烟草的 NRG1 在调节 EDS1 下游的 ETI 中很重要。可以想象，在本氏烟草中，EDS1 - SAG101 - NRG1 节点在调节抗病性和细胞死亡方面起着关键作用，而在拟南芥中，该节点则更专注于 HR。未来，在本氏烟草中生成类似于拟南芥 SETI 的 ETI 诱导系，研究本氏烟草 PAD4 和本氏烟草 SAG101 介导的 ETI 特异性反应，与拟南芥进行比较，剖析 ETI 特异性下游信号，这可能会为 ETI 介导的生长防御权衡和免疫启动提供更多有价值的见解。总之，本研究提供了有价值的数据集，有助于剖析 ETI 介导的免疫启动和生长抑制的模块化机制，为更具创新性的植物抗病育种奠定基础。
研究的局限性
本研究也存在一些局限性。首先，研究主要依赖 RNA - seq 数据，虽然揭示了一些 PAD4 和 SAG101 特异性的组件，但由于缺乏染色质免疫沉淀测序（ChIP - seq）和转座酶可及染色质测序（ATAC - seq）数据集，无法构建 PAD4/SAG101 特异性的基因调控网络（GRNs）。整合这些数据集将更全面地理解 PAD4 和 SAG101 的调控机制。此外，RNA - seq 数据反映的是早期 ETI 诱导高峰期的静态基因表达，无法捕捉这些调控机制的时间动态变化，而这对于全面理解它们在植物免疫中的作用至关重要。其次，研究仅专注于针对细菌生物营养体的启动试验，这种反应是否适用于其他病原体类别（如坏死营养体），仍是未来需要研究的重要领域。最后，当前的实验设置无法区分野生型植物中 E2 相关的效应，因此差异表达基因列表中可能还包含独立于 EDS1 家族起作用的 E2 响应基因。
资源可用性
致谢
研究人员感谢 Marc Gebauer 在突变体基因分型方面提供的技术支持，以及 Ewout van Diepen 在实验中给予的宝贵帮助，他们的贡献对本研究的成功完成至关重要。H.C.、H.H.N.、P.-M.Y. 和 P.D. 感谢欧洲研究委员会启动基金 “R - ELEVATION”（资助协议：101039824）的支持。J.D.G.J. 得到了盖茨比慈善基金会（英国）的资助。研究人员还感谢初稿的读者提供的宝贵反馈和指出的错误，并已将这些修改纳入到本文中，同时欢迎更多有助于改进论文的建议和评论。
作者贡献
Pingtao Ding 负责研究项目的概念构思和整体监督。实验工作由 Pingtao Ding、H.C. 和 P.-M.Y. 共同完成。数据分析和图表制作由 H.C.、H.H.N.、P.-M.Y. 和 Pingtao Ding 完成。J.D.G.J. 全程参与项目，提供了有价值的讨论，对研究产生了重要影响。H.C. 和 Pingtao Ding 撰写了初稿，所有共同作者参与了后续的修订和编辑过程。最终稿件由 H.C. 和 Pingtao Ding 整理完成，并经所有作者批准提交。
利益冲突声明
作者声明不存在利益冲突。
STAR★Methods
关键资源表
研究中使用的细菌和病毒菌株包括 Pseudomonas fluorescens（Pf0 - 1）、Pst DC3000 hrcC、Pst DC3000 EV 等；生物样本有拟南芥的多个品系，如 Col - 0（WT）、SETI（SETI_wt）以及各种突变体；使用的化学试剂有二甲基亚砜（DMSO）、β - 雌二醇、氯化镁六水合物等；关键商业检测试剂盒包括 HiScript II 逆转录酶、DNase I（RNase - free）等；沉积数据包括原始 RNA - seq 数据集（ENA：PRJEB62154）和源数据及统计摘要（Zenodo：
https://doi.org/10.5281/zenodo.14673399 ）；寡核苷酸有 AvrRps4_F、AvrRps4_R 等引物；使用的软件和算法包括 GGplot2、ComplexHeatmap 等。
实验模型和研究对象详情
本研究使用拟南芥 Col - 0 和 β - 雌二醇（E2）诱导的 Super - ETI 系（SETI_wt）作为野生型对照。通过将先前报道的突变体与 SETI 植物杂交，获得了脂肪酶样突变体 SETI eds1 - 2（SETI_eds1）、SETI pad4 - 1（SETI_pad4）、SETI sag101 - 1（SETI_sag101）、SETI pad4 - 1 sag101 - 1（SETI_ps）以及辅助 NLR 突变体 SETI adr1 - 1 adr1 - L1 adr1 - L2 nrg1a nrg1b（SETI_helperless）、SETI nrg1a nrg1b（SETI_nrg1s）、SETI adr1 - 1 adr1 - L1 adr1 - L2（SETI_adr1s）。
在实验中，种子经过液体灭菌处理后，播种在含有或不含 50 μM E2 的 GM 培养基平板上，在 21°C、长日照（16 小时光照，8 小时黑暗）、50% 湿度的条件下培养。用于实验的细菌菌株包括 Pseudomonas syringae pv. tomato（Pst）DC3000 EV（携带空载体）、Pst DC3000 hrcC− 、Pseudomonas fluorescens（Pf0 - 1）等，它们在含有相应抗生素的 King’s B 培养基平板上，于 28°C 培养 2 天，用于后续的接种准备。
方法详情
在新鲜重量测量实验中，种子经处理后播种在方形培养皿上，18 天后，将 6 株幼苗合并测量鲜重，使用 R 版本 4.3.1 进行统计分析，通过 ANOVA（p ≤ 0.05）确定显著因素，用最小显著差异（LSD）检验（p ≤ 0.05）识别处理和品系之间的差异，详细统计摘要可在 GitHub 获取。
RNA - seq 实验中，用含有不同处理液（DMSO、E2、细菌等）的溶液浸润 5 - 6 周龄拟南芥叶片，收集叶片样本提取 RNA，由 Novogene 进行测序。原始读数经处理后，映射到 TAIR10 拟南芥基因组 / 转录组或 AtRTD2_QUASI 数据集，进行差异基因表达分析和统计分析，筛选出差异表达基因（DEGs），并进行 GO 术语分析。
电解质泄漏实验中，用 E2 或 mock 处理 5 周龄拟南芥叶片，收集叶盘，在特定条件下孵育后测量电解质泄漏，使用 ANOVA（p ≤ 0.05）和 Tukey - HSD - Test（p ≤ 0.05）进行统计分析，详细统计摘要可在 GitHub 获取。
半定量实时 PCR 实验中，从 RNA - seq 提取的 RNA 合成互补 DNA（cDNA），以 AvrRps4 特异性引物和 EF1α 引物进行 PCR 反应，产物在 1.5% TAE 琼脂糖凝胶上电泳比较。
细菌生长实验中，培养 Pst DC3000 EV 细菌，调整浓度后浸润叶片，收集叶盘样本，在不同时间点处理样本，通过在选择性培养基上培养并计数菌落，来测定细菌生长情况，使用 ANOVA（p ≤ 0.05）和 Tukey - HSD - Test（p ≤ 0.05）进行统计分析，详细统计摘要可在 GitHub 获取。
叶绿素含量估计实验中，用不同处理（E2、Pst DC3000 hrcC− 等）处理 5 周龄拟南芥叶片，收集叶盘样本，研磨后用 80% 丙酮提取，通过测量吸光度计算叶绿素含量，使用 ANOVA（p ≤ 0.05）和 Tukey - HSD - Test（p ≤ 0.05）进行统计分析，详细统计摘要可在 GitHub 获取。
量化和统计分析
本研究使用 R 版本 4.3.1<进行数据分析，利用 ggplot2 生成箱线图和柱状图，使用 complexheatmap、complexupset、enhancedvolcano 等 r 包绘制热图、upset 图和火山图等，还运用了多个 r 包进行数据格式化和统计分析，rna - seq>
补充信息
文章提供了三个补充信息文件，分别为 Document S1（包含 Figures S1 - S9）、Data S1（包含 Tables S1 - S18）和 Document S2（包含文章及补充信息），可从相应链接下载获取。
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