探秘细胞质趋化受体：双 HAMP 结构域调控核仁阵列与信号传导的关键作用

本文聚焦于粘球菌（Myxococcus xanthus）的细胞质趋化受体 FrzCD。研究发现其双 HAMP（组氨酸激酶、腺苷酸环化酶、甲基接受趋化蛋白和磷酸酶）结构域，能调节核仁阵列形成及下游信号传导，影响细胞聚集和运动等行为，为理解趋化受体机制提供新视角。

引言

细菌通过复杂的化学传感系统（CSS）感知外部信号并转化为细胞行为。甲基接受趋化蛋白（MCPs）作为专门的化学感受器，能感知化学信号。典型的 MCP 由多个结构域组成，其中 HAMP（组氨酸激酶、腺苷酸环化酶、MCP 和磷酸酶）结构域在信号转导和受体定位中发挥重要作用 。MCPs 可寡聚化形成高度有序的阵列，对信号放大至关重要，不同细菌中其亚细胞定位和分布存在差异。

粘球菌（Myxococcus xanthus）具有多阶段发育周期，其 Frz 系统是研究较多的 CSS，能调节细胞运动方向逆转频率，对发育周期成功进行至关重要。FrzCD 是该系统中的细胞质 MCP，缺乏明显传感结构域，其如何感知环境信号尚不清楚。FrzCD 除了具有保守的 C 端甲基接受（MA）结构域外，N 端带正电区域负责与 DNA 结合，此前研究表明其能在核仁上形成多个簇，且这种核仁介导的聚类与跨膜化学传感阵列一样，能使系统协同响应外部信号。

结果

1. 结构预测和同源性分析表明 FrzCD 中存在双 HAMP 结构域：通过对 FrzCD 的二级结构预测和序列比对，发现其 N 端 31 - 136 位氨基酸区域存在两个连续的 HAMP 结构域，分别命名为 H1（31 - 83 位氨基酸）和 H2（84 - 137 位氨基酸）。同源模型显示 FrzCD 呈圆柱形结构，H1 和 H2 可能存在不同构象，且主要为 α 螺旋结构，这一结果通过圆二色谱光谱得到验证。基于这些发现，重新定义了 FrzCD 的结构域架构，包括新确定的双 HAMP 单元。
2. FrzCD 的 HAMP 结构域调节甲基化介导的逆转频率调控：构建 FrzCD - mNeongreen（FrzCDmNG）融合蛋白，发现其在不同表达条件下功能不同。系统删除 HAMP 结构域后，发现 H1 和 H2 功能非冗余，缺失 H1 导致单细胞逆转频率降低，缺失 H2 则导致逆转频率增加，两者同时缺失表型与缺失 H1 相似。逆转频率缺陷与 FrzCD 的甲基化状态相关，缺失 HAMP 结构域会改变其甲基化状态。此外，在高信号浓度下，HAMP 突变体仍能向下游 Frz 蛋白传递信号。
3. FrzCD HAMP 结构域缺失对核仁结合后簇形成有不同影响：观察不同 FrzCD HAMP 突变体与 Neongreen 融合蛋白的细胞定位，发现缺失 HAMP 结构域不影响簇形成和 DNA 结合，但会影响簇的强度和数量。缺失 H1 的细胞，簇的强度和分布与野生型相似但不太清晰；缺失 H2 的细胞形成的簇较少但荧光强度高；缺失两个 HAMP 结构域的细胞形成高度浓缩的簇，数量略多于野生型。
4. HAMP 结构域降低 FrzCD 与 DNA 的亲和力，而 MA 结构域有利于 FrzCD - DNA 稳定复合物的形成：通过异源表达和纯化不同的 His₆标记的 FrzCD 结构域及全长蛋白，进行电泳迁移率变动分析（EMSA）和生物层干涉测量（BLI）。结果表明，FrzCD 与 DNA 的结合是电荷依赖性的，MA 结构域对稳定 FrzCD 在大 DNA 片段上的寡聚化很重要，缺失 HAMP 结构域会改变 FrzCD 与 DNA 的结合亲和力，同时缺失 H1 和 H2 会显著增强其与 DNA 的结合。
5. 双 HAMP 结构域在无 DNA 时限制寡聚化：利用尺寸排阻色谱结合多角度光散射（SEC - MALS）测量不同 FrzCD 构建体的寡聚状态，发现全长 FrzCD 和 FrzCD^ΔMA在高浓度下仍以二聚体形式存在，而缺失 H1、H2 或两者的构建体则形成更高阶的寡聚体。添加 DNA 后，FrzCD 形成高阶寡聚体，而 FrzCD^ΔMA仍为二聚体，这表明 MA 结构域是 FrzCD 寡聚化所必需的，双 HAMP 结构域在无 DNA 时可防止寡聚化。

讨论

MCP 阵列形成对化学传感通路的激活和信号放大至关重要。细胞质 MCP FrzCD 利用核仁作为支架形成动态簇，本研究确定了其双 HAMP 结构域的存在及功能。体外实验表明，双 HAMP 结构域主要防止无 DNA 时 FrzCD 形成高阶寡聚体，MA 结构域则决定 DNA 依赖的寡聚化。双 HAMP 结构域还影响 FrzCD 与 DNA 的结合能力，其旋转可能影响 MA 结构域中甲基化位点的可及性，进而影响细胞行为。此外，MA 结构域在体外对 FrzCD 寡聚化有作用，但体内还需要其他因素来稳定阵列形成。本研究揭示了 HAMP 结构域在信号转导和化学传感阵列可塑性方面的新作用，为理解这些保守结构域提供了新视角。

材料和方法

1. FrzCD 结构域架构预测：使用 Psipred 和 Jpred 4 预测 FrzCD 的二级结构，通过 Superfamily、CD - VIST、SMART 等服务器确定其结构域，并进行多序列比对预测结构域边界。
2. FrzCD 的生物信息学分析和建模：将 FrzCD 分为 DNA 结合（DB）、双 HAMP（H1 和 H2）和甲基接受（MA）结构域，分别建模后叠加构建完整的同源模型，同时也使用 AlphaFold2 生成二聚体模型。
3. 细菌菌株和质粒：列出研究中使用的Myxococcus xanthus和Escherichia coli菌株及质粒，详细描述了构建各种菌株和质粒的方法，包括基因敲除、融合蛋白构建和诱导表达等。
4. 运动表型分析：通过在不同琼脂浓度的平板上培养细胞，观察其在不同条件下的运动和子实体形成情况。
5. 逆转频率测定：在含有或不含有诱导剂的 TPM 琼脂上培养细胞，通过时间 - lapse 电影记录并手动计数细胞的逆转频率。
6. 荧光显微镜和图像分析：使用荧光显微镜观察细胞中 FrzCD 的定位，并结合 DAPI 染色研究其与 DNA 的共定位，利用相关软件分析荧光强度和簇的位置。
7. Western 和甲基化分析：通过 SDS - PAGE 和 Western blot 检测蛋白，并使用 FIJI 软件分析甲基化程度。
8. 蛋白质纯化：分别介绍了从 pHis17 和 pETphos 质粒表达的蛋白质的纯化方法，包括亲和色谱和离子交换色谱等步骤。
9. 圆二色谱光谱：使用 Jasco J - 720 分光偏振计进行远紫外 CD 测量，分析蛋白的二级结构。
10. 电泳迁移率变动分析（EMSA）：用不同长度的 DNA 与纯化的蛋白质孵育，通过琼脂糖凝胶电泳观察 DNA 条带的迁移变化，研究蛋白质与 DNA 的结合。
11. 生物层干涉测量（BLI）：使用 BLItz 仪器进行蛋白质 - DNA 相互作用实验，分析结合动力学。
12. 尺寸排阻色谱结合多角度光散射（SEC - MALS）：利用该技术测定蛋白质在溶液中的摩尔质量和寡聚状态，以及添加 DNA 后的变化。