综述：CRISPR/Cas9基因编辑技术在遗传性视网膜疾病治疗中的研究进展

这篇综述系统阐述了CRISPR/Cas9基因编辑技术治疗遗传性视网膜疾病（IRDs）的最新进展，重点分析了视网膜色素变性（RP）等疾病的致病基因靶点（如RPE65、CEP290）、碱基编辑（BE）和先导编辑（PE）技术优势，以及腺相关病毒（AAV）递送系统的创新突破。作者指出该技术有望突破传统基因疗法的局限性，为显性负性突变等难治性IRDs提供精准治疗方案。

Abstract
遗传性视网膜疾病（IRDs）作为高收入国家工作年龄人群致盲的首要原因，具有显著的临床和遗传异质性。以视网膜色素变性（RP）为代表的IRDs涉及超过300个致病基因，其中约50%为显性负性突变，传统基因补充疗法难以奏效。CRISPR/Cas9技术通过双链断裂（DSB）诱导的DNA修复机制，为这类疾病提供了革命性的治疗策略。

Introduction
视网膜光感受器层由视杆细胞和视锥细胞构成，其功能依赖于视网膜色素上皮（RPE）和Müller胶质细胞的支持。RP的早期特征表现为夜盲症和周边视野进行性狭窄，晚期伴随视锥细胞继发性退化。尽管临床已批准RPE65基因疗法LUXTURNA^®
，但其适用性受限于AAV载体的包装容量（<4.7kb）。EDIT-101临床试验首次证实了CRISPR/Cas9通过切除CEP290基因IVS26突变剪接位点治疗Leber先天性黑蒙（LCA）的可行性。

CRISPR/Cas9 therapeutic applications for IRDs
SpCas9和SaCas9分别识别NGG与NNGRRT PAM序列，通过非同源末端连接（NHEJ）引入移码突变可有效敲除致病等位基因。针对RHO基因p.P23H突变，NHEJ介导的indel效率达35%，显著改善小鼠视网膜电图（ERG）反应。而微同源介导末端连接（MMEJ）可精确删除RPGR基因c.2405-2407缺失，修复率达28%。

Base and prime editing for IRDs
碱基编辑器ABE7.10在RPE65基因c.280T>G突变校正中实现92%的A>G转换效率。先导编辑系统PE3在体外成功修复USH2A基因c.2299delG突变，精确插入缺失的鸟嘌呤而不诱发DSB。值得注意的是，双AAV载体递送的PE系统在视网膜组织表现出<5%的脱靶率。

Emerging technologies
突变非依赖性策略如NRL基因启动子表观遗传调控，通过dCas9-DNMT3A融合蛋白甲基化可使光感受器存活率提升3倍。针对PRPH2/RDS基因的CRISPRa系统利用MS2-p65-HSF1激活内源表达，补偿常染色体显性突变的功能缺失。

Delivery systems
新型AAV衣壳变体AAV2-7m8突破内界膜屏障，视网膜下注射后光感受器转染率达78%。病毒样颗粒（VLPs）装载SaCas9-gRNA复合物在非人灵长类模型中显示12周的持续编辑活性。值得关注的是，脂质纳米颗粒（LNPs）递送mRNA编码的Cas9-VQR可实现视网膜全层递送，且免疫原性较AAV降低60%。

Outstanding issues
当前挑战包括SpRY-Cas9在NRN PAM位点的编辑效率波动（15-65%），以及HITI技术在终末分化细胞中整合率不足5%。临床转化还需解决AAV中和抗体（NAb）阳性患者的递送替代方案。

Concluding remarks
随着变形式核酸酶（transposase-Cas9）和线粒体靶向gRNA的突破，CRISPR/Cas9技术有望实现对IRDs的精准打击。未来需建立标准化脱靶检测平台（如DISCOVER-Seq），并通过类器官模型验证长期安全性。