Munc13-1局部翻译修复介导突触前功能恢复在脊髓性肌萎缩症中的机制研究

本研究针对脊髓性肌萎缩症(SMA)突触前病理机制，发现SMN蛋白缺失导致Munc13-1 mRNA轴突转运障碍和局部翻译缺陷。通过替换3'UTR恢复Munc13-1表达，成功挽救SMA小鼠神经肌肉接头(NMJs)突触结构、神经传递功能和运动表现，为靶向突触治疗SMA提供了新策略。

脊髓性肌萎缩症(Spinal Muscular Atrophy, SMA)是一种由SMN1基因突变导致的神经肌肉疾病，以运动神经元退化和神经肌肉接头(Neuromuscular Junctions, NMJs)功能损害为主要特征。尽管当前针对SMN蛋白水平的治疗策略在早期应用时可有效延缓疾病进展，但对于错过治疗窗口期的患者效果有限，这突显了深入理解SMA突触功能障碍机制的必要性。突触前神经递质释放异常在SMA病理中扮演关键角色，但具体分子机制尚未完全阐明。Munc13-1作为突触前活性区(Active Zones, AZs)的核心蛋白，在囊泡锚定和 priming过程中起重要作用，其与Rab3A、RIM形成的三联复合物调控神经递质释放概率和突触可塑性。近期研究发现UNC13A基因在肌萎缩侧索硬化症(ALS)中作为生存修饰因子，但其在SMA中的作用仍待探索。

本研究通过多种先进技术方法揭示SMA中Munc13-1的调控机制。研究人员使用台湾型重度SMA小鼠模型(C57BL/6J.Smn1^tm1Msd/J)和人诱导多能干细胞(hiPSC)来源的运动神经元，结合微流控室培养、超分辨率显微镜(lattice-SIM)、膨胀显微镜(ExM)和单分子荧光原位杂交(smFISH)等技术，发现SMA运动神经元中Munc13-1 mRNA的轴突转运和局部翻译显著受损。通过构建3'UTR替换的Munc13-1救援载体(将Munc13-1编码区与Synaptophysin1的3'UTR融合)，成功恢复了Munc13-1的轴突定位和局部翻译。此外，利用条件性基因敲入小鼠模型(ROSA26^Unc13-1tg/+)，证明恢复Munc13-1表达可改善SMA小鼠的NMJ结构、运动功能和生存期。

Munc13-1局部翻译在SMA轴突和突触前终末中的失调

研究发现SMA运动神经元轴突中Munc13-1 mRNA水平降低约75%，smFISH显示其轴突和生长锥内定位减少，免疫荧光证实蛋白水平同步下降。通过嘌呤霉素邻近连接 assay(Puro-PLA)检测发现，SMA运动神经元轴突生长锥中Munc13-1的局部翻译显著减弱。皮质突触体核糖体 pulldown实验进一步显示，SMA小鼠中与翻译核糖体结合的Munc13-1 mRNA减少，表明SMN缺失直接影响其局部翻译过程。

Munc13-1 mRNA轴突定位依赖其3'UTR并受SMN调控

通过构建三种慢病毒救援载体：含同义3'UTR的野生型Munc13-1(wtMunc13-1)、Munc13-1编码区融合SynPhy3'UTR(Rescue)以及缺失3'UTR的构建体(RescueΔ3'UTR)，发现Rescue构建体可有效恢复SMA运动神经元中Munc13-1 mRNA的轴突定位，而RescueΔ3'UTR仅增加胞体mRNA水平，证明3'UTR在轴突靶向中的关键作用。免疫染色显示救援构建体表达增加了生长锥中Munc13-1蛋白水平。

Munc13-1局部翻译是刺激依赖性超分子簇形成的必要条件

使用Roscovitine(一种增强钙内流的化合物)刺激运动神经元，发现5分钟内Munc13-1免疫反应性显著增加，该过程被蛋白质合成抑制剂anisomycin阻断，而非微管破坏剂nocodazole，表明依赖局部翻译而非胞体运输。lattice-SIM超分辨率成像显示，刺激后Munc13-1簇数量增加且结构重组，形成新的释放位点。膨胀显微镜(ExM)进一步解析纳米尺度结构，发现刺激后每个簇内Munc13-1纳米组装体数量从6.18增加至8.07，相邻组装体中心间距缩短，表明刺激诱导了Munc13-1的局部合成和簇重组。

Munc13-1恢复挽救培养SMA运动神经元的神经元兴奋性

囊泡回收 assay显示，Rescue构建体表达显著改善SMA运动神经元的突触囊泡释放，部分挽救见于RescueΔ3'UTR组。免疫染色证实救援表达增加了活性区蛋白(RIM1/2、Piccolo、Bassoon)和电压门控钙通道Cav2.2在生长锥中的水平。钙成像显示，Rescue组自发性钙瞬变频率和振幅增加，且去极化 evoked反应改善，表明神经元兴奋性恢复。

Munc13-1恢复改善SMA小鼠的运动功能

通过条件性基因敲入小鼠模型(Smn^KOR26^Unc13-1tg/+)，发现SMA小鼠NMJ去神经支配率从15%降至3%，腰椎L1/L2段ChAT⁺运动神经元数量减少得到缓解。行为学测试显示翻正反射、四肢抓力显著改善，生存期从10天延长至14天。

人iPSC来源运动神经元中UNC13A mRNA和蛋白轴突定位异常

在SMA患者来源的iPSC运动神经元中，同样观察到UNC13A mRNA轴突转运减少和蛋白水平下降。表达UNC13A-SYP3'UTR救援载体可恢复其轴突定位和Cav2.2簇集，验证了小鼠模型中的发现。

研究结论表明，Munc13-1作为SMA的修饰因子，其局部翻译缺陷是突触前病理的核心机制。恢复Munc13-1表达不仅挽救突触结构和功能，还通过稳定活性区蛋白和钙通道增强神经元兴奋性。该研究首次揭示Munc13-1 mRNA的SMN依赖性轴突转运和局部翻译在维持突触可塑性中的关键作用，为开发针对突触病理的SMA治疗策略提供了新方向。论文发表于《Nature Communications》，为理解神经退行性疾病中突触功能障碍机制提供了重要见解。