新型白介素12锚定药物偶联物(Tolododekin Alfa)在晚期实体瘤中的首次人体试验：局部滞留增强抗肿瘤免疫并展现良好安全性

为解决系统性免疫激动剂毒性强、治疗窗口窄的问题，研究人员开展新型IL-12锚定药物Tolododekin Alfa的首次人体试验。该研究通过铝氢氧化物的静电锚定实现肿瘤局部药物滞留，在15例晚期实体瘤患者中显示良好安全性（无DLT或≥3级治疗相关不良事件），60%患者获得疾病稳定，并证实局部CD8+ T细胞浸润、PD-L1上调和免疫微环境重塑。该研究为锚定免疫疗法提供了临床概念验证。

免疫疗法彻底改变了肿瘤治疗格局，尤其是免疫检查点阻断在实体瘤和嵌合抗原受体T细胞疗法在血液恶性肿瘤中的应用。然而，与阻断T细胞抑制的检查点抑制剂不同，免疫激动剂直接作用于效应T细胞和自然杀伤（NK）细胞以刺激增殖和抗肿瘤效应功能。尽管许多免疫激动剂在临床前肿瘤模型中显示出强大的治疗活性，但由于需要超生理剂量的全身给药才能实现疗效，导致治疗窗口狭窄和药代动力学（PK）特性差，限制了其临床开发。例如，高剂量白介素2（IL-2）被批准用于治疗肾细胞癌和转移性黑色素瘤，但需要大剂量推注输注，导致显著毒性并需要重症监护管理。同样，其他有前景的免疫激动剂，包括靶向CD28、4-1BB、CD40和IL-12的药物，也因显著的全身毒性而受阻。

为了克服这些挑战，将激动剂局部滞留在肿瘤部位是一种有前景的策略。局部递送或肿瘤靶向方法被认为可以通过最大化肿瘤部位的免疫激活来增强治疗效果，从而促进全身抗肿瘤免疫，同时最小化全身暴露和相关毒性。此类策略代表了释放免疫激动剂在癌症治疗中全部潜力的关键机会。然而，直接将激动剂（如重组IL-12）注射到肿瘤中并未成功降低毒性，这可能是由于药物快速扩散出肿瘤导致全身吸收。

研究人员开发了一种药物平台，通过利用与铝氢氧化物的稳定非共价偶联，实现肿瘤内持久的局部滞留。Tolododekin alfa（原名ANK-101）由全长人IL-12与铝氢氧化物的稳定偶联组成，铝氢氧化物作为药物呈递的惰性支架。该药物由p35和p40 IL-12亚基组成，IL-12链的C末端延伸出一个铝结合肽（ABP）。ABP含有可被可变磷酸化的丝氨酸残基，产生负电荷，从而与铝氢氧化物上的羟基残基相互作用。在给药前将IL-12-ABP与铝氢氧化物短暂混合即可生成Tolododekin alfa。

IL-12由髓样细胞、CD4⁺ T辅助细胞和B淋巴母细胞产生，调节先天性和适应性免疫反应。IL-12由两个亚基组成：p35（调节信号传导）和p40（对受体结合至关重要）。p40亚基与其他IL-12家族成员（如IL-23）共享。IL-12诱导干扰素γ（IFN-γ）产生，促进Th1分化，并增强CD8⁺ T细胞和NK细胞效应功能，在从先天性免疫向适应性免疫过渡以及介导肿瘤抗原特异性反应中发挥着至关重要的作用。全身性IL-12先前已在人类中显示出治疗活性，但与不可接受的毒性和死亡率相关。

在一项Phase 1试验中，重组IL-12（3-1000 ng/kg/天）通过静脉（IV）推注给药，每3周给药5天。虽然两名患者（黑色素瘤、肾细胞癌）显示出客观缓解，四名患者疾病稳定（SD），但严重的毒性（包括肝转氨酶升高和口腔炎）限制了其使用。随后一项使用每周两次IV推注（30-700 ng/kg）的研究确定了最大耐受剂量（MTD）为500 ng/kg。在高于500 ng/kg的剂量下，显著的剂量限制性毒性（DLT）包括转氨酶升高、4级中性粒细胞减少症和溶血性贫血。尽管有部分活性证据，全身毒性阻碍了IL-12的临床开发。

Tolododekin alfa小鼠替代物的临床前研究显示，药物在肿瘤内滞留数周，并在各种小鼠肿瘤模型中显示出单药治疗活性，且无毒性证据。小鼠Tolododekin alfa促进了效应CD8⁺ T细胞的募集，增强了IFN-γ的产生，增加了局部PD-L1的表达，并诱导了持久的促炎基因表达。此外，Tolododekin alfa的犬用版本在一项针对晚期黑色素瘤犬的Phase 1临床试验中进行了评估，显示出良好的安全性，客观缓解率为29%，持久疾病控制率为47%，并且在一例受试者中观察到远隔效应（非注射的肺转移瘤部分消退）。

基于这些发现，研究人员假设Tolododekin alfa在人类癌症患者中具有可接受的安全性，并且PK模型预测药物在局部滞留，其生物学活性将导致局部IFN-γ和PD-L1上调。为了验证这一假设并收集关于疗效和生活质量的初步数据，在一例晚期、浅表可及实体瘤患者中进行了Tolododekin alfa的Phase 1试验。本文数据代表了锚定药物偶联物在晚期实体瘤患者中的首次人体报告。

为开展研究，研究人员主要采用了以下关键技术方法：1) 采用标准3+3剂量递增设计，对15例晚期实体瘤患者进行Tolododekin alfa瘤内注射；2) 使用电化学发光（ECL）为基础的Meso Scale Discovery（MSD）测定法进行药代动力学（PK）分析，定量血清中的IL-12-ABP；3) 利用多因子检测评估血清细胞因子水平（如IFN-γ）；4) 对治疗前后的肿瘤活检组织进行免疫组化（IHC）分析CD8⁺ T细胞浸润和PD-L1表达；5) 使用NanoString PanCancer IO 360 Panel进行肿瘤微环境转录组分析。

结果

患者与治疗

从2024年2月5日至11月20日，共有15例患者在此剂量递增单药治疗阶段（Part 1）接受了治疗。患者特征总结于表1。中位年龄为68岁（范围36-79），其中6名（40%）男性和9名（60%）女性入组。基线ECOG体能状态为0者9例（60%），为1者6例（40%）。所有患者均接受过既往治疗，其中11例（73.3%）患者接受过超过三种方案，4例（26.7%）患者接受过≤三种既往方案。除两名患者外，所有患者均在接受既往免疫治疗后进展。治疗的肿瘤为黑色素瘤（n=7；46.7%）、头颈癌（n=4；26.7%）、乳腺癌（n=2；13.3%）和顶泌腺癌（n=1；6.7%）。

总共筛选了31例患者，15例患者入组。所有15例患者均纳入安全性分析集。13例患者纳入疗效分析，因为2例受试者在首次评估前终止研究。一名患者（队列1；2μg/mL）因社会原因在一次注射后撤回同意。没有患者因不良事件而停止治疗。三名患者因疾病进展在完成所有四个周期之前被移除治疗。三名患者接受了所有四个计划周期，八名患者接受了超过四个周期，并因持续临床获益而继续研究治疗。中位给药次数为每位患者4次（范围1-8），每位患者中位注射肿瘤数为1个（范围1-6）。每位患者中位注射体积为8mL（范围0.5-32 mL）。

安全性

本研究的主要终点是安全性和耐受性。所有患者均未报告DLT。任何患者中均未发生3级或以上治疗相关治疗 emergent不良事件（TEAE）或严重不良事件（SAE）。此外，未观察到与操作相关的TEAE。有一例3级SAE（软组织感染）发生在接受20μg/mL队列Tolododekin alfa治疗的患者中，该事件经全身抗生素治疗后缓解，被认为与Tolododekin alfa无关。最常见的治疗相关不良事件总结于表2。最常见的是疲劳（n=2）和肌痛（n=2）。在大多数情况下，疲劳、流感样综合征和发热等炎症相关不良事件在给药后立即发生。值得注意的是，有两例患者（分别在20μg/mL和120μg/mL队列）报告了三起1级发热事件，可能源于轻度细胞因子释放综合征。发热后允许使用对乙酰氨基酚进行预用药，此事件在后续给药中未再发生。未发现显著的实验室异常，任何患者的中性粒细胞与淋巴细胞比率（NLR）均无变化。

药代动力学与免疫原性

确定扩展推荐剂量（RDE）是研究的另一个主要终点，基于所有患者完成第一个治疗周期后的安全性、PK和PD数据。第一个治疗周期后所有患者的血清浓度总结于图1A（左）和补充表3。观察到系统药物暴露呈剂量依赖性增加的趋势；然而，在剂量队列内部和之间，个体PK谱存在显著变异性。前八名患者（队列1-4）的血清浓度范围从四名患者无法定量到非常低的水平，C_max范围为19.2-139 pg/mL。相比之下，队列5和6中的系统性IL-12-ABP水平更易检测到，中位C_max为103 pg/mL（范围18.2-693 pg/mL），中位T_max为24小时（范围0.5-168小时）。在大多数具有可测量PK谱的患者中，IL-12-ABP在最后时间点（168小时）仍可检测到。

为了评估肿瘤滞留效率，将C_max表示为总给药剂量的百分比（补充表4）。结果表明，在C_max时，总剂量中只有极小部分（0.02-0.67%）存在于全身系统，表明Tolododekin alfa有效地将生物活性IL-12-ABP成分锚定在肿瘤内。

在第二个治疗周期后，所有患者均持续检测到系统性IL-12-ABP水平。与周期1的观察结果相似，周期2后的血清浓度普遍较低，所有队列的中位数为59.5 pg/mL（范围13.8-1010 pg/mL）。显著的人群间和人群内变异性持续存在，在剂量>60μg/mL时IL-12-ABP水平有更高的趋势（图1A和补充表5）。周期2后的总系统暴露量明显低于周期1，所有患者的T_last均为48小时（图1B）。

另一个次要终点是Tolododekin alfa的免疫原性。在基线以及周期1和周期3后评估了针对IL-12-ABP蛋白的循环抗药物抗体（ADA）的存在。在前12名患者（队列1-5）中，只有两名患者ADA检测呈阳性，阳性出现在周期3之后（补充表6）。这些初步发现表明IL-12-ABP蛋白的免疫原性较低。

疗效

一个次要终点是评估初步的临床活性。根据标准RECIST v1.1标准，总体疾病控制率为60.0%（表3）。在疾病控制者中，五名受试者的反应维持了24周或更长时间，七名参与者（47%）接受了完整的8个周期治疗。所有治疗队列的反应蜘蛛图显示，9名患者在所有剂量下均达到SD（图2A）。一名患者根据RECIST v1.1在八个周期后实现了客观部分缓解（PR）。该患者在最后一次ANK-101给药后第24周达到反应，因此未计算反应持续时间。此外，另一名患者在四个周期后靶病灶出现PR，但随后因出现新病灶而进展。靶病灶的瀑布反应显示在补充图4中。我们还评估了注射病灶的反应，并看到了类似的反应模式（补充图5）。一名患者仍在接受积极治疗并正在随访反应。在中位随访5.2个月时，中位SD持续时间为5.3个月（范围3.6-7.6个月），总结在游泳者图中（图2B）。在本次分析时，PFS数据尚不成熟，中位PFS无法评估（95% CI, 2.57-NE）。尽管研究中未包括用于反应评估的系列病理学检查，但系列照片记录了一名接受60 mg/mL Tolododekin alfa治疗的转移性膀胱癌患者的几个注射病灶完全消退（图2C）。观察到较高的测量系统IFN-γ与疾病控制之间存在相关性趋势，达到SD或PR最佳反应的患者峰值中位IFN-γ为191.8（15.7-2369.1），而疾病进展（PD）患者为28.9（17.7-6083.0）（p值0.42）。三名患者（黑色素瘤、膀胱癌和头颈鳞状细胞癌）在治疗1和3个周期后获得了注射病灶的活检，显示无存活肿瘤残留炎症（图2D）。

血清细胞因子的诱导

探索性终点包括评估接受Tolododekin alfa的患者生物标志物的变化。根据补充表7中的时间表收集外周血样本，并分离血清用于细胞因子分析。IFN-γ是响应IL-12信号传导产生的主要细胞因子。在所有患者中检测到治疗后系统性IFN-γ水平升高（图1C）。在队列1-3中，循环IFN-γ水平较低，峰值中位数为77.9 pg/mL（范围17.7-496.4 pg/mL）。观察到剂量依赖性上升趋势，队列4-6的峰值中位数为559.9 pg/mL；然而，水平变化很大（范围19.0-6083 pg/mL）。对于大多数患者，IFN-γ峰值水平发生在给药后48小时。在接受多个治疗周期的患者中，给药前IFN-γ恢复到不可检测的水平，并在后续剂量中可靠地重新诱导。除IL-12p70外，其他测量的细胞因子变化极小，IL-12p70水平升高归因于循环的IL-12-ABP（图1D）。总体而言，这些发现表明Tolododekin alfa在局部给药后具有生物活性，并诱导IL-12介导的免疫激活，有剂量依赖性药效学反应的证据支持，并且这种活性在重复给药时持续存在。

肿瘤微环境的重塑

按照补充表8中的方案收集肿瘤活检，以评估治疗相关的TME变化。在治疗后21天收集的活检中，差异基因表达分析表明，与配对的预处理样本相比，多种指示免疫激活和反调节机制的标志物持续上调（图3A, B）。观察到与T细胞、Th1细胞、CD8⁺ T细胞、耗竭CD8细胞、巨噬细胞、树突状细胞、细胞毒性细胞相关的基因表达特征显著增加。上调最多的基因包括编码IL-2受体α链（IL2RA）的基因；IL12RB2, STAT4（IL-12信号传导），免疫检查点分子（CTLA4, PD-1, TIGIT, PD-L1, PD-L2）；趋化因子（CXCL9, CXCR3, CCL5）；细胞毒性效应分子（PRF1, GZMA, GZMK），M1巨噬细胞（CD38和CD86）（图3B）。这些基因表达变化在所有可评估的剂量队列、所有评估的肿瘤类型以及注射和非注射肿瘤中一致观察到（图3C）。

肿瘤炎症评分（TIS）和CD8⁺ T细胞基因特征的上调与治疗结果相关，达到PR或SD的患者与那些药效学（PD）患者相比，评分显著更高（图3D）。使用IHC进一步表征TME，以检测和量化CD8⁺ T细胞的肿瘤浸润，以及评估免疫细胞和肿瘤细胞的PD-L1表达。与配对的基线活检相比，大多数治疗后样本显示CD8⁺ T细胞浸润（图4A）和PD-L1表达（图4B）显著增加，与NanoString基因分析结果一致。PD-L1综合阳性评分（CPS）的上调和CD8⁺ T细胞浸润与治疗结果相关，达到PR或SD的患者显示PD-L1 CPS评分或CD8 T细胞浸润增加（图4C）。治疗明显上调了肿瘤细胞（TPS）和免疫细胞（IC）上的PD-L1表达以及CPS（补充表9）。

在一名接受60μg/mL Tolododekin alfa治疗的转移性膀胱癌患者中，在第一次注射Tolododekin alfa后观察到TME的变化（图3D）。这些变化包括CD8⁺ T细胞水平增加6倍（图4A），以及PD-L1表达的CPS增加10倍（图4B）。在该肿瘤周期3后收集的活检显示CD8⁺ T细胞（补充图6A）和PD-L1表达（补充图6B）恢复到治疗前水平。然而，病灶表现出近乎完全的消退，细胞结构减少和坏死增加，可能反映了有效的免疫反应，随后随着肿瘤被破坏而收缩（图2D）。

在其他肿瘤类型的患者中也观察到类似的治疗后CD8⁺ T细胞浸润和PD-L1表达变化，包括IV期转移性乳腺癌（接受20μg/mL治疗）、肢端雀斑样痣黑色素瘤（接受20μg/mL Tolododekin alfa治疗）、皮肤黑色素瘤（接受60μg/mL治疗）和转移性HNSCC（接受60μg/mL治疗）。在HNSCC患者中，第一次Tolododekin alfa注射后观察到CD8 T细胞增加4.3倍，PD-L1 CPS增加23.3倍（图4A, B）。与先前在转移性膀胱癌患者中的观察一致，病灶呈现高度坏死，未检测到存活肿瘤细胞，进一步支持了肿瘤细胞消除后局部免疫收缩的假设（图2D）。总之，这些数据表明Tolododekin alfa治疗诱导了TME的深刻重编程，这与IL-12的已知生物学和先前的临床前观察一致。

高度上调的IL-12通路相关基因如图所示，进行了双侧统计分析。C 热图显示了所有可评估剂量队列、所有评估的肿瘤类型以及注射和非注射肿瘤中，每个患者在一个周期（C2D1）和三个周期给药（C4D1）后的差异特征评分。D 肿瘤炎症评分（TIS）和CD8⁺ T细胞基因特征的上调与治疗结果相关，总共8名患者（n=6（SD）和n=2（PD））。条形图中标明了平均值±SEM。通过配对t检验计算双侧P值。表示p=0.05，*表示p=0.009。

+ 和B PD-L1染色的代表性IHC图像，来自不同剂量队列和肿瘤类型的个体患者治疗前和治疗后（21天）的配对肿瘤活检。染色进行一次，染色可评估性由病理学家确定。条形图指示了病理学家评分的相应阳性细胞百分比。C 通过IHC显示的CD8⁺ T细胞浸润（左两图）和PD-L1 CPS评分（右两图）显示于疾病控制（PR/SD；左侧；n=9）或疾病进展（PD；右侧，n=2）的患者；这两个参数在疾病控制患者中均显著增加，总计n=11。条形图中标明了平均值±SEM。通过配对t检验计算双侧P值，表示p=0.023，*表示p=0.008。源数据可在源数据文件中找到。'>

讨论

Tolododekin alfa是一种新型的IL-12锚定药物偶联物，设计用于在肿瘤微环境中长期滞留。这种修饰的目的是在不引起靶上、脱肿瘤毒性的情况下介导抗肿瘤免疫。在这项首次人体研究中，Tolododekin alfa耐受性良好，没有DLT或3级及以上治疗相关的TEAE或SAE。最常见的治疗相关不良事件是低级别体质性症状，包括疲劳、流感样疾病和肌痛（表2）。两名患者出现1级发热，可能与轻度细胞因子释放综合征有关，但两例均无意外缓解，并且在患者使用对乙酰氨基酚预用药后未再发生。

IL-12与铝氢氧化物的偶联是通过铝结合肽上的带负电荷磷酸盐与铝氢氧化物上的羟基残基之间的静电相互作用介导的。铝氢氧化物是一种惰性金属，近一个世纪以来一直被用作疫苗佐剂，基于铝氢氧化物可能具有免疫佐剂特性的观念。这一假设最近受到质疑，并且铝氢氧化物单独似乎不太可能激活免疫反应，尤其是Th1型反应。此外，铝氢氧化物作为治疗佐剂的潜在作用可能取决于剂量、给药途径和治疗背景。我们先前报道，锚定在铝氢氧化物上的小鼠IL-12导致强大的抗肿瘤免疫，而单独的铝氢氧化物没有效果。因此，在瘤内注射后，铝氢氧化物通常充当惰性支架，允许局部IL-12滞留。由于铝氢氧化物不易被酶降解，作为递送平台，它允许更高的局部细胞因子浓度和更长的局部半衰期用于药物递送。

IL-12锚定药物偶联物在肿瘤部位滞留的证据由PK分析提供。直接瘤内注射后，系统药物水平通常非常低，尤其是在前四个剂量队列中。在一名接受总剂量300μg的患者中，第二次治疗周期后观察到的系统C_max为1010 pg/mL。在该患者中，这仅相当于总给药剂量的0.58%。相比之下，静脉注射IL-12在MTD（500 ng/kg）下的C_max据报道约为3,000 pg/mL，假设体重70公斤，这约占总剂量的24%。在所有患者中，在第一个和第二个治疗周期后，Tolododekin alfa的C_max水平仅占总给药剂量的一小部分（远低于1.0%），表明有效的肿瘤滞留。观察到的低系统暴露，由有效的肿瘤滞留驱动，是锚定免疫疗法的预期特征，因为药物与铝氢氧化物稳定连接。系统暴露在第二个治疗周期后显著减少。这种减少不太可能归因于ADA，因为在给药前样本中未检测到ADA。其他合理的解释包括可能影响系统药物吸收的TME变化。这些可能涉及由于IL-12R表达上调而增加的靶标介导的药物处置、影响药物扩散的基质结构改变、增强的局部药物在肿瘤内的隔离、浸润淋巴细胞对Tolododekin alfa的吸收增加，或增加的瘤内清除机制。

在利用125I-SPECT成像的小鼠Tolododekin alfa临床前研究中也观察到持久的药物滞留。这些表明约40%的药物偶联物在注射后28天仍留在肿瘤中。在一项针对晚期粘膜黑色素瘤犬的Phase 1研究中，Tolododekin alfa的犬用版本诱导的促炎基因表达在一些犬中持续长达84天，并与T细胞募集到肿瘤部位、局部PD-L1表达增加和诱导血清IFN-γ相关。在这项犬类研究中，观察到治疗活性而没有DLT，表明局部药物滞留跨多个物种是相似的。基于临床前数据的混合效应药效学模型表明，系统IFN-γ产生和肿瘤微环境中的PD-L1表达将是人类生物活性的关键指标。

良好的安全性特征支持患者可以耐受高达250μg/mL的Tolododekin alfa。先前的PK建模和药物成像研究表明，进一步提高剂量可能不会改善药物生物分布或IL-12信号传导。这些数据进一步表明，继续剂量递增可能不太可能改善治疗活性。事实上，即使在较低的给药剂量下，IL-12在局部的 prolonged滞留可能足以介导抗肿瘤活性。与此一致的是，我们在除最低剂量2μg/mL外的所有剂量队列中都发现了疾病控制。因此，选择250μg/mL作为进一步扩展的推荐剂量。

与PK模型预测一致，系统和局部药效学生物标志物的评估证实了Tolododekin al