AAV载体介导的NF1基因替代疗法开发——靶向神经纤维瘤的膜靶向截短神经纤维蛋白研究

本研究针对神经纤维瘤病1型（NF1）相关肿瘤治疗难题，通过开发膜靶向截短神经纤维蛋白（GRDC24）并利用腺相关病毒（AAV）载体递送系统，成功构建了具有高效肿瘤靶向性和低肝脏摄取的新型AAV-K55载体。该载体在多种NF1相关肿瘤模型中显著抑制肿瘤生长，为NF1基因治疗提供了创新性解决方案。

神经纤维瘤病1型（NF1）是一种常染色体显性遗传病，由于NF1肿瘤抑制基因的功能丧失导致RAS信号通路持续激活，进而引发全身多系统肿瘤。患者不仅面临良性神经纤维瘤的困扰，其中约50%会发展成恶性外周神经鞘瘤（MPNST），目前临床使用的MEK抑制剂虽对部分肿瘤有效，但存在需长期用药、毒性显著且无法根治遗传缺陷的局限性。

为突破NF1基因治疗领域的两大瓶颈——NF1基因尺寸过大（超过8400bp）超出AAV载体包装容量，以及天然AAV血清型对肿瘤组织靶向性不足的难题，约翰斯·霍普金斯大学研究团队在《Nature Communications》发表了创新性研究成果。他们通过精巧的分子设计将神经纤维蛋白的GAP相关结构域（GRD）与KRAS4B羧基端结构域融合，创建了膜靶向截短蛋白GRDC24，并采用胶囊DNA洗牌技术和随机肽库筛选策略，成功开发出具有特异肿瘤靶向能力的新型AAV-K55载体。

研究团队运用多项前沿技术：通过胶囊定向进化技术（包括DNA洗牌和体内生物淘选）筛选肿瘤靶向载体；利用患者来源的神经纤维瘤细胞系（ST88-14、ipNF95.1bc）和iPSC分化模型进行功能验证；采用正交移植瘤模型（坐骨神经移植）评估体内靶向性；通过流式细胞术和免疫组化定量分析转导效率；并建立NF1-iPSC来源的神经鞘细胞分化模型验证治疗机制。

优化NF1 GRD作为rAAV载体有效载荷

研究人员系统评估了不同RAS异构体超变区（HVR）与GRD的融合效果，发现KRAS4B羧基端24个氨基酸（C24）融合构建体（GRDC24）在NF1缺失细胞中表现出最强的RAS信号抑制活性。进一步通过长度优化确定333氨基酸版本（NF1 1200-1532 AA）具有最高表达水平和功能效力，该构建体包含Spred1结合序列，能显著增强膜定位和凋亡诱导能力。

GRDC24在NF1-/-细胞中恢复神经鞘细胞分化能力

在NF1缺失iPSC衍生的神经嵴细胞模型中，AAV介导的GRDC24表达不仅有效抑制pERK1/2信号，更重要的是恢复了神经鞘细胞分化能力。与神经元共培养实验显示，治疗组细胞能够形成髓鞘结构（MPZ阳性），重现了正常神经鞘细胞的生理功能。

创建针对NF1肿瘤的特异性rAAV载体

通过多轮胶囊DNA洗牌筛选，研究人员从12种天然AAV血清型中获得了候选载体AAV-557-2。该载体在移植瘤模型中显示显著降低的肝脏摄取和增强的肿瘤靶向能力。进一步通过VR-VIII环随机七肽库筛选，最终获得了顶级候选载体AAV-K55，其插入肽段"SKVPLPN"显著提升了对NF1肿瘤的特异性转导。

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AAV-K55的系统性应用特性

药代动力学研究显示AAV-K55的血浆半衰期为1.22天，与常规AAV载体相似。血清学分析表明其抗体流行率与AAV9相当（结合抗体17.5%，中和抗体26%），提示具有较好的临床转化潜力。值得注意的是，该载体在健康组织中转导有限，未检测到周围神经和视神经的转导。

AAV-K55-GRDC24的治疗效果

在ST88-14和RHT92移植瘤模型中，单次给药（10¹² vg）即显著抑制肿瘤生长，但4周后出现复发。两次给药方案（间隔7天）或更高剂量（2×10¹² vg）可实现持续抑制。联合MEK抑制剂司美替尼（selumetinib）治疗显示协同效应，为临床联合用药提供依据。

本研究

本研究的重要意义在于成功攻克了NF1基因治疗的两大技术瓶颈：通过精巧的分子设计解决了大基因包装难题，采用定向进化策略突破了肿瘤靶向递送障碍。所开发的AAV-K55载体具有三大突出优势：特异性靶向NF1肿瘤组织、显著降低肝脏毒性、能够恢复神经鞘细胞正常分化功能。

值得注意的是，该研究采用的胶囊进化策略具有广泛适用性，为其他单基因遗传病和肿瘤的靶向治疗提供了可复制的开发范式。尽管在快速增殖的肿瘤治疗中仍需优化给药方案（如多次给药或联合用药），但这项研究无疑为NF1患者带来了新的希望，标志着基因治疗在肿瘤领域应用的重要突破。