靶向p300/CBP降解消除H2B乙酰化增强子组抑制前列腺癌进展

本研究揭示p300/CBP介导的组蛋白H2B N端乙酰化（H2BNTac）是前列腺癌致癌增强子组的标志特征。通过新型PROTAC降解剂CBPD-409实现p300/CBP双重降解，可彻底消除H3K27ac和H2BNTac，显著抑制雄激素受体（AR）信号通路，在临床前模型中有效抑制肿瘤生长且无毒性，为增强子成瘾性癌症提供了创新治疗策略。

H2BNTac在前列腺癌病变中显著升高

研究团队通过检测前列腺癌患者匹配的良性和恶性肿瘤组织中的组蛋白翻译后修饰，发现组蛋白H2B N端乙酰化（H2BNTac）在前列腺癌组织中显著增加。H2BNTac包括H2BK5ac、H2BK12ac、H2BK16ac和H2BK20ac，已知这些修饰标记活跃的增强子区域。免疫荧光染色显示，与患者匹配的相邻良性上皮相比，角质蛋白8（KRT8）阳性恶性细胞中H2BK5ac和H2BK20ac水平显著升高。组织微阵列分析进一步证实了H2BK5ac和H2BK20ac在前列腺癌组织中的明显升高。

通过DepMap数据库（v.24Q2）对AR阳性前列腺癌细胞系（VCaP和LNCaP）中所有组蛋白乙酰转移酶（HAT）和组蛋白去乙酰化酶（HDAC）的必要性评分进行累积分析，发现p300是最必需的基因，而p300在AR阴性前列腺癌细胞系（PC3和DU145）中是非必需的。进一步评估显示，与良性上皮相比，原发性前列腺癌组织中p300及其类似物CBP的表达一致增加。H2BNTac信号与前列腺癌组织中的p300/CBP水平呈强正相关。染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）证实，大多数H2BK5ac（82.3%）和H2BK20ac（76%）组蛋白标记与前列腺癌细胞中的p300峰重叠，而较小部分的H3K18ac（46.7%）和H3K27ac（46.3%）位点与p300峰重叠，支持H2BNTac对p300的依赖性。

p300是前列腺癌致癌增强子组的关键决定因子

p300与转录因子（TF）共定位以调节基因表达。研究团队探索了p300与AR或ETS转录因子ERG（ERG）在VCaP细胞中的相互作用。根据标准化读取密度，将致癌转录因子（AR、ERG和FOXA1）和转录辅因子（SMARCA4、p300和BRD4）在非启动子区域的ChIP-seq峰分为四分位数（Q4代表顶部四分位数）。随后评估了它们在AR或ERG结合位点的存在。正如预期，最强的AR或ERG峰（Q4峰）大多数由先锋转录因子FOXA1和辅因子SMARCA4共占据。与BRD4不同，p300与超过60%的最强AR和ERG Q4峰共定位。此外，与AR重叠的大多数p300峰是高置信度（Q3或Q4）信号。

接下来，研究团队在VCaP细胞中分析了p300的cistrome，并将AR结合位点分类为共享（AR/p300共结合）或独占（仅AR）。尽管AR结合强度在组间相似，但AR/p300共结合位点（占AR cistrome的48%）显示出更高的染色质可及性，以及更多的Mediator复合物亚基1（MED1）和BRD4招募，同时H3K27ac和H2BK20ac水平增加。相比之下，仅AR位点的可及性较低，辅因子结合和组蛋白乙酰化减少。AR/p300共结合位点更频繁地形成超级增强子，包括在 recurrent致癌基因位点如TMPRSS2、AR和MYC。Hi-ChIP分析显示，与仅AR位点相比，更大比例的AR/p300共享增强子环化到活性启动子。几个关键的AR靶基因，包括KLK2、TMPRSS2、CCND1和ZBTB16，仅由AR/p300共享增强子调节。新生RNA测序（RNA-seq）证实AR/p300共享增强子具有显著更高的转录输出。对于ERG也观察到类似模式，p300在调节ERG结合增强子中起关键作用。

AR和ERG在顺式调节元件上合作，在前列腺癌中形成超活化增强子。一致地，AR/ERG共享位点显示比仅AR或仅ERG区域更强的H2BNTac和p300富集。值得注意的是，大多数ERG/AR共结合核小体是p300富集的，辅因子占据、活性组蛋白标记和染色质可及性增加。这些发现表明，p300是定义前列腺癌细胞中活性致癌增强子组的关键决定因子。

p300/CBP降解消除H2BNTac

在LNCaP细胞中，CRISPR介导的p300敲除显著降低了组蛋白H3和H2B乙酰化，同时靶向p300和CBP导致更明显的组蛋白乙酰化损失。在22Rv1细胞中，需要抑制p300和CBP两者才能抑制组蛋白乙酰化，表明类似物之间的功能补偿以及需要靶向两者以完全阻断前列腺癌中的H2BNTac。

p300/CBP溴结构域抑制剂CCS1477目前处于早期临床试验阶段；因此，研究团队测试了CCS1477和另一种溴结构域抑制剂GNE-049在AR阳性前列腺癌细胞中的疗效。尽管两种化合物都减少了H3K27ac，但H2BNTac的丰度几乎没有减少，表明溴结构域抑制剂仅部分抑制p300/CBP活性。为了实现完全抑制，研究团队开发了CBPD-409，一种基于GNE-049弹头的cereblon（CRBN）依赖性PROTAC降解剂，旨在降解p300和CBP两者。在多个细胞系中，CBPD-409在1小时内显著降解p300和CBP蛋白。基于质谱的蛋白质组学分析在前列腺癌细胞中证实，CBPD-409特异性降解p300和CBP，而不影响其他溴结构域蛋白，包括BET家族成员或已知的CRBN新底物，如GSPT1和Ikaros。与游离沙利度胺配体竞争或使用carfilzomib进行蛋白酶体抑制完全阻断了CBPD-409对p300/CBP的降解。非活性类似物CBPD-409-me不降解其靶标。与先前报道的p300/CBP降解剂dCBP-1和JQAD1相比，CBPD-409在前列腺癌细胞系中表现出增强的降解效果。

用CBPD-409降解p300/CBP消除了H3K27ac和H2BNTac，而不影响羧基末端组蛋白H2B lysine 120乙酰化（H2BK120ac）标记。相比之下，GNE-049和CCS1477均未消除H2BNTac水平。基于免疫沉淀的质谱分析发现了组蛋白尾上的几个乙酰标记，包括H2BNTac，这些标记随着CBPD-409处理迅速丢失。ChIP-seq显示，CBPD-409导致染色质上H2BK5ac和H2BK20ac峰的完全丢失，而GNE-049仅对H2BK5ac和H2BK20ac有 modest影响。与p300/CBP HAT抑制剂A485和其他p300/CBP降解剂dCBP-1和JQAD1相比，CBPD-409最有效地抑制了H2BNTac和H3K27ac。这些发现表明，p300/CBP在溴结构域抑制剂存在下保留部分催化功能，并突出了CBPD-409在完全消除前列腺癌细胞中p300/CBP致癌组蛋白乙酰化程序方面的功效。

p300/CBP降解破坏致癌组蛋白乙酰化

尽管CBPD-409和GNE-049都引发了整体H3K27ac组蛋白修饰丰度的类似下降，但 motif分析显示，CBPD-409优先消除前列腺癌特异性转录因子结合位点的H3K27ac峰。与这一观察一致，CBPD-409在AR和ERG增强子处触发了H3K27ac和H2BNTac的几乎完全丢失，特别是在AR/ERG共结合的超活化增强子处。另一方面，溴结构域抑制剂GNE-049在AR和ERG增强子组上适度抑制了H3K27ac和H2BNTac。CBPD-409减少了ERG/AR/p300共结合以及仅由p300结合的增强子处的H2BK20ac，表明CBPD-409广泛破坏H2BNTac标记的增强子。在AR超级增强子处也观察到一致的结果，其中CBPD-409比GNE-049更有效地抑制了H3K27ac和H2BNTac水平。

为了在患者中证实发现，研究团队利用来自患者组织的AR cistrome数据区分CRPC特异性AR新增强子与正常AR增强子。值得注意的是，在VCaP细胞中，AR CRPC特异性新增强子与正常增强子之间的p300富集没有显著差异。然而，p300/CBP降解严重减弱了CRPC特异性AR新增强子处的H3K27ac，表明CBPD-409在CRPC中禁用致癌AR增强子组。

接下来，研究团队进行了转座酶可及染色质测序（ATAC-seq）以探索p300/CBP降解对染色质可及性的影响。与SMARCA2/4降解剂AU-15330不同，CBPD-409不改变染色质可及性。在p300/CBP降解后，也未检测到AR或FOXA1的染色质结合变化，表明p300/CBP降解不改变转录因子对染色质的访问。相比之下，CBPD-409处理显著抑制了辅因子BRD4向AR增强子的招募。此外，共免疫沉淀 assay显示，CBPD-409处理显著增加了AR与HDAC3的相互作用，HDAC3是核受体辅阻遏物复合物的核心组成部分，表明p300/CBP降解不仅破坏辅激活因子招募，还增强AR增强子组上的辅阻遏物加载。这些发现表明，p300/CBP降解迅速消耗组蛋白乙酰化，并以p300依赖性方式支持AR增强子复合物的分层组装。

p300/CBP降解剂消除致癌转录

基于RNA-seq数据的基因集富集分析（GSEA）显示，p300/CBP降解抑制了雄激素反应和增殖相关通路。在LNCaP细胞中，CRISPR介导的p300和CBP双重敲除模拟了PROTAC降解剂，显著抑制了AR和MYC靶基因。p300/CBP降解还以时间依赖性方式显著降低了AR、前列腺特异性抗原（PSA）和MYC的蛋白水平。MYC和NKX3-1（一个AR靶基因）转录本被CBPD-409迅速抑制，这与蛋白质组学数据一致。值得注意的是，CBPD-409的抑制效果比溴结构域抑制剂或HAT抑制剂更显著。用CBPD-409预处理1小时完全减弱了前列腺癌细胞中配体诱导的AR转录活性。这伴随着CBPD-409处理细胞中RNA聚合酶II（Pol II）在AR上调基因启动子处的加载显著减少。在新生的RNA-seq数据中，发现标志性的AR调节转录本 among 最显著下调的基因。大部分下调的新生转录本包括增强子RNA，也从AR结合顺式调节元件模板化。总之，p300/CBP降解引发AR增强子处乙酰化标记的迅速丢失，并损害增强子元件及其远端靶基因的后续转录。

p300/CBP降解剂阻断致癌基因程序

超过45%的被CBPD-409下调的基因没有被溴结构域抑制剂可比地抑制，p300/CBP降解显示出更强的基因表达抑制。GSEA揭示，独特的CBPD-409抑制基因与前列腺癌细胞中生长相关信号通路相关。在被CBPD-409独特下调的基因中，确定了NKX3-1、CITED2和CCND1，这些基因已知在前列腺癌进展中起关键作用。能够在蛋白质水平确认这些基因的对比效果。值得注意的是，与游离沙利度胺共同处理，它阻断CBPD-409的降解活性，逆转了H2BNTac的丢失以及NKX3-1、CBP/p300相互作用转录激活因子与Glu/Asp-rich羧基末端域2（CITED2）和cyclin D1（CCND1）的表达，但仍然导致减少的H3K27ac和MYC抑制，模拟溴结构域抑制剂的效果。这些结果表明，溴结构域抑制的p300/CBP的残留H2BNT乙酰转移酶活性继续支持重要促癌基因的表达。作为正交方法，用CBPD-409的非活性类似物CBPD-409-me处理显著减少了H3K27ac，但对H2BNTac组蛋白修饰影响不大，并且未能抑制降解特异性基因靶标。对NKX3-1和CCND1基因座的评估证实，用CBPD-409处理后，这些基因处的H2BK20ac和Pol II加载显著耗尽，而不影响H3K27ac，这在用GNE-049处理后未观察到。值得注意的是，与其他p300/CBP PROTAC降解剂和HAT域抑制剂相比，CBDP-409在抑制NKX3-1、CITED2和CCND1水平方面表现出最显著的效果。

与先前报道CITED2促进前列腺癌转移一致，Boyden chamber Matrigel侵袭实验显示，p300/CBP降解显著降低了LNCaP和22Rv1细胞的侵袭能力，而p300/CBP溴结构域抑制剂未观察到显著变化。这些发现表明，尽管抑制了溴结构域，p300/CBP复合物仍保留其H2BNT赖氨酸残基的乙酰转移酶活性，这维持了前列腺癌中的致癌增强子活性。

p300/CBP降解抑制肿瘤生长而无毒性

使用CRISPR敲除和小干扰RNA技术，研究团队证实AR阳性前列腺癌细胞的生长被靶向p300/CBP显著抑制。与遗传方法一致，用CBPD-409处理在所有测试的AR阳性前列腺癌细胞系中导致比GNE-049更强的细胞毒性。值得注意的是，CBPD-409显示出钩效应，在LNCaP和22Rv1细胞中最高剂量时细胞毒性降低，与PROTAC机制一致，其中高浓度由于靶标和E3连接酶饱和而阻碍三元复合物形成和泛素化。尽管靶标降解，CBPD-409在AR阴性前列腺癌（PC3和DU145）、神经内分泌前列腺癌（NCI-H660和LTL-331R-CL）或正常人类前列腺衍生细胞系（WPMY-1、PNT2和RWPE1）中显示无疗效。CBPD-409在AR阳性前列腺癌细胞系中也表现出优于其他已发表的p300/CBP降解剂、溴结构域抑制剂或HAT域抑制剂的细胞毒性。正如预期，非活性PROTAC CBPD-409-me具有与GNE-049相似的细胞毒性谱。CBPD-409即使在GNE-049耐药的LNCaP细胞中也表现出强细胞毒性。

令人印象深刻的是，在来自20个不同谱系的136个细胞系的大规模 panel 中评估CBPD-409的细胞毒性，发现AR阳性前列腺癌细胞是最敏感的模型之一。该筛选还揭示了多发性骨髓瘤和神经母细胞瘤细胞系，它们显示出对p300/CBP的急性依赖，对CBPD-409显著敏感。相比之下，p300/CBP降解在HEK293FT和RWPE1细胞中未显示任何显著的生长相关通路抑制，支持p300/CBP在这些正常细胞系中的非必需作用。

接下来，研究团队使用PRISM多重筛选平台在更大的887个癌细胞系 panel 中评估CBPD-409的疗效。其中，6%（52/887）表现出强敏感性（剂量反应曲线下面积（AUC）<0.3），而51%（449/887）对CBPD-409完全耐药（AUC>0.8），强调了CBPD-409的显著选择性。谱系富集分析显示，增强子驱动的AR阳性前列腺癌、神经母细胞瘤、横纹肌样瘤和急性髓系白血病 among 对CBPD-409治疗最敏感。PRISM数据与DepMap药物重定位数据集的整合显示，CBPD-409与HAT抑制剂A485之间的相关性最强。值得注意的是，溴结构域抑制剂显示出较弱的相关性，反映了它们对p300/CBP活性的部分抑制。PRISM筛选还确定了p300依赖性（CRISPR基因必要性评分）与CBPD-409敏感性之间的最强正相关。然而，未观察到CBP依赖性与CBPD-409敏感性之间的显著相关性，表明p300依赖性是CBPD-409疗效的更强决定因素。有趣的是，转录适配器1（TADA1）、SPT7 like STAGA复合物亚基γ（SUPT7L）、TATA-box结合蛋白相关因子5 like（TAF5L）、SPT20同源物（SUPT20H）和转录适配器2B（TADA2B），它们是Spt–Ada–Gcn5乙酰转移酶（SAGA）复合物的亚基，显示出与CBPD-409敏感性的显著正相关，并且是与p300共依赖的顶级基因，强调了增强子驱动恶性肿瘤对组蛋白超乙酰化的严重依赖。这得到了CBPD-409敏感细胞中H2BNTac水平升高 compared 耐药正常和癌细胞的 support。在CBPD-409敏感细胞（AR阳性VCaP）和CBPD-409耐药细胞（AR阴性DU145和PC3）中进行的 spike-in ChIP-seq assay 进一步证实了AR/p300结合增强子位点处H2BNTac的显著更高富集，表明H2BNTac可以作为预测p300/CBP靶向治疗疗效的生物标志物。

为了评估p300/CBP降解的安全性，研究团队在免疫 competent CD1小鼠中进行了毒性研究。CBPD-409在多个器官中有效降解p300/CBP，而不影响体重或器官重量。终点（第32天）的组织学检查显示重要器官无毒性。CBPD-409不影响任何前列腺叶，并且未发现萎缩、透明变性、纤维化或任何肿瘤现象的出现。血液分析证实对肝或肾功能或血液成分无 adverse影响。值得注意的是，与p300/CBP溴结构域抑制剂或BET抑制剂不同，CBPD-409未引起血小板减少症或巨核细胞丢失或杯状细胞耗竭。唯一观察到的副作用是可逆的生殖细胞成熟缺陷和睾丸萎缩。在人性化Crbn小鼠（hCRBN小鼠）中的进一步评估显示，CBPD-409不诱导明显毒性。尽管有效降解p300/CBP，但在重要器官中未观察到毒性，甚至在CD大鼠中也是如此。肝和肾功能以及血小板计数在CBPD-409处理后保持不变。与人类原代CD3⁺ T细胞、自然杀伤细胞和 immortalized B细胞（GM24694）中的BRD4降解剂ZBC-260不同，CBPD-409显示无细胞毒性。总之，研究结果揭示，p300/CBP降解选择性抑制增强子驱动癌细胞的生长，同时保留正常组织。

p300/CBP降解剂与enzalutamide在CRPC中协同作用

CBPD-409被设计为具有高口服生物利用度（50%）和有利的药代动力学，使其与先前报道的p300/CBP PROTAC区分开来。在初始体内功效研究中，使用VCaP衍生的异种移植肿瘤在 intact SCID小鼠中，口服给予3 mg kg⁻¹ CBPD-409显著抑制肿瘤生长，而无明显毒性。

接下来，在去势抵抗性VCaP-CRPC模型中，尽管CBPD-409单独显著抑制肿瘤生长，但与enzalutamide联合导致超过60%的动物（18只中的11只）消退。治疗5天后肿瘤异种移植物的免疫组织化学（IHC）染色和 western blotting 证实p300/CBP、AR、PSA、MYC、Ki67、CCND1、NKX3-1、CITED2、H3K27ac和H2BK20ac显著下调。

与体内数据一致，CBPD-409和enzalutamide的联合治疗在抑制VCaP细胞方面显示出显著的协同作用（Bliss评分23.8）。CBPD-409在亲代和enzalutamide耐药的LNCaP细胞系之间保持相当的疗效。在治疗enzalutamide耐药患者衍生异种移植模型MDA-PCa-146-12时，联合治疗 profoundly抑制肿瘤生长。研究团队进一步使用内部CRPC患者衍生异种移植模型WA-74，该模型固有地对enzalutamide耐药。在这里，CBPD-409和enzalutamide的联合治疗显著抑制了WA-74肿瘤的生长。在更具侵袭性的WA-74 CRPC模型中，CBPD-409和enzalutamide的组合显著抑制肿瘤生长并增强了荷瘤小鼠的生存。总之，体外和体内功效数据表明，使用CBPD-409靶向p300/CBP蛋白进行降解代表了一种有前途的晚期AR依赖性前列腺癌治疗策略，同时表现出最小的 on 或 off-target毒性。