靶向共享新抗原的T细胞受体工程化T细胞治疗急性髓系白血病的探索

时间：2025年10月26日

来源：Blood Cancer Journal

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本研究针对急性髓系白血病（AML）患者因恶性髓系前体细胞基因突变积累导致的预后极差问题，开展了靶向共享新抗原的T细胞受体（TCR）工程化T细胞治疗研究。研究人员通过数据驱动方法从NPM1、FLT3等高频突变基因中筛选出HLA-A*02:01限制性新抗原，证实了NPM1/W288fs、FLT3/D835H等新抗原可诱导特异性T细胞反应，并从健康供体中成功分离出特异性TCR序列。研究证实工程化T细胞能特异性识别并杀伤内源性表达相应突变的AML细胞，为AML的过继性细胞治疗提供了新策略。

在血液肿瘤的战场上，急性髓系白血病（AML）一直是成人中最常见的白血病类型，这种疾病的治疗如同在雷区中穿行——尽管标准治疗方案包含诱导化疗、强化化疗和造血干细胞移植（HSCT），但多数患者会在初始响应后面临复发难治的困境，最终导致极差的预后。这种治疗困境的根源在于恶性髓系前体细胞中基因突变的持续积累，使得肿瘤细胞能够逃避免疫系统的监视。

传统的靶向药物如FLT3-ITD和IDH1突变抑制剂虽然为部分患者带来希望，但其疗效持续时间有限，且耐药性问题突出。更为棘手的是，并非所有 recurrent genomic alterations 都有有效的抑制剂可用。这就促使科学家们将目光投向了一个新兴领域——新抗原（neoantigen）免疫治疗。这些由体细胞突变产生的特异性抗原只存在于恶性细胞表面，如同给癌细胞贴上了"专属标签"，既能引发强效免疫反应，又避免了"误伤"正常细胞的off-tumor毒性风险。

在这项发表于《Blood Cancer Journal》的重要研究中，Zhou Weijun、Yu Jinyi等研究人员开展了一项创新性探索，旨在开发靶向AML共享新抗原的T细胞受体（TCR）工程化T细胞治疗策略。他们面临的科学问题很明确：能否找到AML中常见的共享新抗原？这些新抗原是否能被T细胞特异性识别？能否分离出高效的特异性TCR，并以此构建能够精准杀伤AML细胞的工程化T细胞？

为了回答这些问题，研究团队采用了一套系统的研究方法。他们首先通过RNA测序和靶向DNA panel分析10例HLA-A02:01阳性新诊断AML患者的热点突变，利用NetMHCpan 4.1预测新肽段与HLA-A02:01的结合亲和力，并在973例AML患者队列中验证HLA/新肽段共现频率。通过AlphaFold和分子对接预测三维结构，采用T2细胞结合实验和UV介导肽段交换实验验证结合亲和力与复合物稳定性。利用双色标记tetramer技术检测患者外周血和骨髓浸润淋巴细胞中新抗原特异性T细胞，从健康供体体外诱导新抗原特异性T细胞并通过单细胞排序和TCR测序鉴定优势TCR序列。最后构建嵌合TCR（保留人可变区，替换为鼠恒定区）并通过慢病毒转导制备TCR工程化T细胞，通过细胞因子检测、LDH释放实验和体内小鼠模型评估其功能活性。

数据驱动筛选AML原发性患者的候选新抗原

研究人员采用数据驱动方法筛选候选新抗原，包括新肽段的识别和结合亲和力预测、评估AML队列中HLA/新肽段共现情况，以及三维结构预测和对接分析。由于HLA-A*02:01在人群中流行率较高，被选为后续研究的限制性HLA等位基因。

通过对10例HLA-A02:01阳性新诊断AML患者的骨髓样本进行分析，研究人员鉴定了30个非同义突变，其中NPM1、FLT3、TP53和DNMT3A四个基因的热点突变被检测到。NetMHCpan 4.1预测显示，来自NPM1/W288fs、FLT3/D835H、FLT3/D835Y、FLT3/N676K、DNMT3A/R899H、TP53/G266V和TP53/H193D的七个新肽段对HLA-A02:01表现出强结合亲和力（%Rank≤2）。

在包含973例患者的合并AML数据集中，这七个新肽段均反复出现，表明靶向这些共享新肽段的免疫治疗可能为相当大比例的患者带来益处。分子对接和分子动力学模拟进一步证实了候选新肽段与HLA-A*02:01分子之间存在稳定的相互作用。

新抗原的HLA结合亲和力和解离的实验确认

通过UV介导肽段交换和T2细胞实验验证了七个候选新肽段与HLA-A02:01分子的结合能力。其中四个新肽段——NeoNPM1/W288fs（AIQDLCLAV）、NeoFLT3/D835H（HIMSDSNYV）、NeoFLT3/D835Y（YIMSDSNYV）和NeoTPS3/H193D（GLAPPQDLI）在体外实验中显示出与HLA-A02:01的强结合亲和力。

T2细胞实验评估pHLA-A*02:01复合物的稳定性显示，NeoTPS3/H193D的DC50（解离复合物50）长于8小时，而NeoNPM1/W288fs、NeoFLT3/D835H和NeoFLT3/D835Y的DC50分别为7.33、7.52和7.57小时。这些稳定的复合物表明这四种新肽段有望与T细胞表面的TCR相互作用。

AML患者中新抗原反应性T细胞的持续存在和动态变化

研究人员使用双色标记的HLA-A*02:01-tetramer检测了AML患者中新抗原特异性T细胞的存在。在携带NPM1/W288fs的三例新诊断AML患者（AML001、AML002和AML003）的外周血中检测到针对NeoNPM1/W288fs的特异性CD8+ T细胞，频率范围为0.018%至0.026%。患者AML006的外周血中检测到针对NeoFLT3/D835Y的特异性CD8+ T细胞，频率为0.04%。

在骨髓微环境中，未接受任何治疗的患者AML001和AML002的MILs中可检测到NeoNPM1/W288fs特异性CD8+ T细胞，患者AML006则有针对NeoFLT3/D835H反应性的CD8+ T细胞（0.013%），表明骨髓内存在针对白血病的持续免疫反应。

对携带FLT3/D835H的患者AML004连续样本的分析显示，完全缓解（CR）阶段NeoFLT3/D835H特异性CD8+ T细胞频率（0.63%）高于初诊时（0.013%），表明在肿瘤负荷较低阶段T细胞对携带FLT3/D835H的白血病细胞清除增强。值得注意的是，该患者在HLA-A*02:01单倍体相合家族供者HSCT后维持CR，移植后一年循环T细胞中仍保留NeoFLT3/D835H特异性T细胞（频率0.0625%）。

IFN-γ ELISPOT实验进一步证实，来自患者AML002、AML004和AML006的CD8+ T细胞分别对NeoNPM1/W288fs、NeoFLT3/D835H和NeoFLT3/D835Y产生显著的IFN-γ分泌。

从HLA-A02:01健康供体中分离新表位特异性TCR*

由于疾病相关的免疫功能障碍和淋巴细胞减少症，直接从AML患者分离足够数量的新肽段特异性T细胞极具挑战性。研究人员从HLA-A*02:01阳性健康供体的PBMCs诱导新肽段特异性T细胞。

与未脉冲的DCs相比，NeoNPM1/W288fs和NeoFLT3/D835H脉冲的DCs能显著诱导CD8+ T细胞分泌IFN-γ。通过HLA-A*02:01-tetramer复合物检测，CD8+ Tetramer+ T细胞的比例对于NeoNPM1/W288fs和NeoFLT3/D835H分别为0.12%和0.37%。

对排序的CD8+ Tetramer+ T细胞进行TCRα和TCRβ测序显示，每个新肽段均观察到优势TCRA和TCRB序列。对于NeoNPM1/W288fs，最常见的TCRA为TRAV17-TRAJ54（65.35%），优势TCRB序列为TRBV5-6-TRBJ2-7（50.37%）。对于NeoFLT3/D835H，优势TCRA为TRAV29-TRAJ34（100%），优势TCRB为TRBV27-TRBJ2-1（45.55%）。而针对NeoFLT3/D835Y的反应中未观察到优势TCRA和TCRB序列。

TCR工程化T细胞的构建及其对新抗原识别能力的验证

研究人员通过用修饰的小鼠对应物替换TCRA和TCRB链的恒定域，同时保留人可变域，构建了嵌合TCR。TCRNPM1/W288fs和TCRFLT3/D835H通过慢病毒载体成功转导至健康供体T细胞。

TCRNPM1/W288fs和TCRFLT3/D835H工程化T细胞能与加载相应新肽段的HLA-A*02:01-tetramer结合，表明这些TCR-T细胞具有突变特异性。ELISA实验显示，当以加载各新肽段的T2细胞为靶细胞时，TCRNPM1/W288fs和TCRFLT3/D835H工程化T细胞以剂量依赖性方式显著分泌IFN-γ和颗粒酶B，而对野生型对应物未观察到反应。

LDH释放实验显示，TCRNPM1/W288fs和TCRFLT3/D835H转导的T细胞在不同效应器/靶标比例下特异性裂解加载NeoNPM1/W288fs和NeoFLT3/D835H的T2细胞，而对加载野生型对应物的T2细胞影响较小。

TCR工程化T细胞杀伤呈递新抗原的AML细胞系和原代AML细胞

为确定构建的TCR工程化T细胞对内源性加工并将其新抗原呈递到细胞表面的AML细胞的反应性，研究人员分别在AML细胞系和原代细胞上进行了检测。

TCRNPM1/W288fs工程化T细胞与OCI-AML3细胞（NPM1/W288fs，HLA-A02:01+）共培养时显示出高水平的IFN-γ和颗粒酶B，而与THP-1细胞（NPM1/W288wt，HLA-A02:01+）相比则无此反应。类似地，OCI-AML3FLT3/D835H细胞能诱导TCRFLT3/D835H工程化T细胞显著分泌IFN-γ和颗粒酶B，而与原始OCI-AML3细胞相比则无此反应。LDH释放实验显示，转导TCRNPM1/W288fs或TCRFLT3/D835H的T细胞对OCI-AML3或OCI-AML3FLT3/D835H细胞表现出显著的杀伤活性，而对其野生型对应物无影响。

使用来自HLA-A02:01阳性患者AML003（NPM1/W288fs）和AML004（FLT3/D835H）的原始细胞作为靶细胞进一步证实了这些TCR转导T细胞的细胞溶解特性。携带TCRNPM1/W288fs和TCRFLT3/D835H的T细胞在20:1效应器/靶标比例下，分别对携带NPM1/W288fs（AML003）和FLT3/D835H（AML004）突变的HLA-A02:01+原代AML样本产生显著的IFN-γ和颗粒酶B分泌，而对缺乏相同突变（AML013）或具有不同HLA基因型（AML011和AML012）的AML原始细胞未观察到反应。此外，这些TCR-T细胞在10:1效应器/靶标比例下在LDH释放实验中裂解携带相应突变的HLA-A*02:01原代AML样本（AML003和AML004），但对缺乏相同突变（AML013）或限制性HLA（AML011和AML012）的AML细胞显示最小裂解。

在免疫缺陷NSG模型中评估TCR工程化T细胞的体内疗效显示，与未治疗对照组相比，输注TCRFLT3/D835H工程化T细胞的小鼠表现出明显的抗白血病效果，总体生存期显著改善。输注TCRFLT3/D835H-T细胞一周后收集的骨髓和脾脏样本分析显示，与未治疗小鼠相比，治疗组小鼠的单细胞悬液中mTCR阳性T细胞浸润显著增加，同时白血病负荷显著降低。