炎症相关小胶质细胞通过TNF信号轴破坏海马胶质网络通讯驱动术后神经认知障碍

本研究针对术后神经认知障碍(PNCI)缺乏有效靶向治疗的问题，开展了关于海马区胶质细胞异质性及网络通讯机制的单细胞测序研究。发现炎症相关小胶质细胞(IAM)术后扩增14倍，通过TNF信号通路主导胶质网络通讯，驱动神经炎症。TNF抑制剂依那西普可逆转IAM活化并改善认知功能，为PNCI防治提供了新靶点。

随着全球人口老龄化和外科技术的发展，接受手术治疗的老年患者日益增多。然而，手术创伤和麻醉等因素使这一人群易患术后神经认知障碍(PNCI)，这种并发症严重影响患者康复进程和生活质量。尽管PNCI具有重要的临床意义，但其发病机制尚未完全阐明，且缺乏有效的靶向治疗方法。海马体作为学习和记忆的关键脑区，已被广泛证实与术后认知功能障碍密切相关。

研究表明，中枢神经系统(CNS)炎症是PNCI发生发展的关键致病驱动因素。作为CNS的常驻免疫细胞，小胶质细胞在调节围手术期炎症和维持内环境稳定中起着至关重要的作用。然而，围手术期小胶质细胞在PNCI发生发展中的贡献、表型异质性和通讯网络仍特征不足。传统上将小胶质细胞简单分为M1(神经毒性和促炎)和M2(神经保护和抗炎)表型的二分法已不能完全捕捉小胶质细胞表型异质性的复杂性。在阿尔茨海默病(AD)模型中，特定小胶质细胞亚群——疾病相关小胶质细胞(DAM)的特征已被描述，但在围手术期海马中小胶质细胞特定亚群的作用及其激活过程中的表型异质性仍知之甚少。

为了解决这些知识空白，郑玉祥等研究人员在《Journal of Neuroinflammation》上发表了题为"Inflammation associated microglial expansion disrupts hippocampal glial network communication, driving postoperative neurocognitive impairment"的研究论文。该研究通过单细胞RNA测序(scRNA-seq)技术，系统描绘了PNCI小鼠海马区胶质和血管细胞的全景图谱，特别聚焦于小胶质细胞的异质性及其细胞间通讯网络。

研究人员为开展本研究主要采用了以下几个关键技术方法：使用18月龄老年小鼠建立PNCI模型并开展行为学测试；对对照组和手术组小鼠海马组织进行单细胞RNA测序分析；通过免疫荧光结合荧光原位杂交(IF/FISH)验证亚群数量和靶RNA转录本表达；利用透射电子显微镜观察血脑屏障超微结构；采用酶联免疫吸附测定(ELISA)检测海马TNF-α水平；通过Morris水迷宫和恐惧条件测试评估认知功能；应用TNF抑制剂依那西普进行干预研究。

Characterization of glial and vascular cell populations in perioperative hippocampus

研究人员对术后24小时的小鼠海马组织进行scRNA-seq分析，共获得20,684个海马细胞，鉴定出10种细胞群，包括小胶质细胞、星形胶质细胞、内皮细胞(ECs)、神经元等。聚焦于血脑屏障损伤、CNS炎症和内环境稳定中具有重要生物学功能的两种胶质细胞群和一种血管细胞群：小胶质细胞(标记基因C1qc，对照组3,814个细胞，手术组4,776个细胞)、星形胶质细胞(标记基因Aqp4，对照组1,183个细胞，手术组1,072个细胞)和内皮细胞(标记基因Flt1，对照组150个细胞，手术组236个细胞)。

Perioperative inflammation associated microglia expanded over 14-fold

对8,590个海马小胶质细胞进行二次聚类分析，鉴定出八个转录不同的亚群：稳态小胶质细胞(HM，占42%)、过渡状态小胶质细胞(TSM，占27%，表达即刻早期基因IEGs和炎症基因)、炎症相关小胶质细胞(IAM，占12%，表达大量炎症相关基因)、疾病相关小胶质细胞(DAM，占6%)以及三个具有抗炎和神经保护基因表达模式的亚群：炎症抑制性小胶质细胞(IIM，占6%)、代谢相关抑制性小胶质细胞(MIM，占2%)和疾病相关抑制性小胶质细胞(DIM，占1%)，其余4%为巨噬细胞。

手术组与对照组相比，小胶质细胞亚群发生显著变化：HM从术前的81%降至9.8%(下降88%)；TSM从1.4%增至47.8%(增加超过33倍)；IAM从1.3%增至21%(增加超过14倍)。这些发现表明手术后海马小胶质细胞稳态被深刻破坏，向过渡状态和炎症相关激活状态转变。

Shift in microglial gene expression patterns from HM to IAM and IIM

伪时间分析显示，小胶质细胞从HM开始，通过以即刻早期基因表达为特征的中间转录状态(TSM)，随后分化为两个不同的分支：促炎(IAM)或抗炎(IIM)基因表达模式。基因共表达网络分析确定了HM、TSM、IAM和IIM这些亚群功能的关键调控基因。

TNF signaling activation in postoperative hippocampal IAM

基于围手术期小胶质细胞亚群的变化，建立了小胶质细胞激活相关信号通路。在IAM中，Tnf及其受体Tnfrsf1a均上调。促炎细胞因子Il1b通过TNF和NF-κB通路上调，导致促炎反应。Ccl2和Tspo在IAM中上调，而Hk2和Prkcd在DAM中升高。IF/FISH双染证实手术组海马中Tnf⁺IBA1⁺细胞(IAM)显著增加。作为IAM的炎症标记基因，Tnf、Tnfrsf1a和Il1b mRNA的荧光强度在手术组海马小胶质细胞中显著升高。作为IAM的趋化因子和线粒体标记基因，Ccl2和Tspo mRNA的荧光强度也在海马小胶质细胞中升高。

Perioperative astrocytic subpopulations remained relatively stable

聚类分析鉴定出六个不同的星形胶质细胞亚群：稳态星形胶质细胞(HA，占36%)、血管生成相关星形胶质细胞(AAA，占3%)、代谢相关星形胶质细胞(MAA，占4%)、疾病和代谢相关星形胶质细胞(DMA，占32%)、疾病相关抑制性星形胶质细胞(DIA，占9%)和代谢相关抑制性星形胶质细胞(MIA，占16%)。与微胶质细胞相比，围手术期星形胶质细胞的变化不太明显：手术组HA从术前39.6%降至32.6%(下降17.5%)，MIA从14.1%增至17.9%(增加26.9%)，其他亚群变化更不显著。

IAM dominated postoperative glial network communication

CellChat分析显示，手术后细胞间通讯增加，小胶质细胞到小胶质细胞、星形胶质细胞到星形胶质细胞以及星形胶质细胞到小胶质细胞的信号显著增强。在小胶质细胞亚群中，IAM和TSM表现出最高的总差异传出和传入相互作用数(IAM=91，TSM=85)和相互作用强度(均为2.7)。在星形胶质细胞亚群中，HA和MAA表现出最高的总差异传出和传入相互作用数(HA=135，MAA=111)和强度(HA=4.4，MAA=4.6)。随后的IAM亚群分析显示，在所有差异通路中，TNF信号在传入和传出相互作用强度方面增加最大。

对微胶质细胞中上调的主要信号通路进一步分析发现，在TNF信号通路中，手术后IAM成为TNF信号的主要调节因子，作为TNF配体的主要来源、TNF相关信号的主要接收者和信号传播中的关键中介。Tnf-Tnfrsf1a配体-受体(L-R)对通讯在手术组IAM中显著增加。在BAFF通路中，手术后IAM通过同时产生BAFF配体、响应BAFF相关线索和参与微胶质网络中的信号中继显示出增强的参与。在CHEMERIN通路中，激活的IAM成为星形胶质细胞源性CHEMERIN信号的主要接收者。在APP通路中，内皮细胞作为APP相关信号的主要来源，主要靶向DIM。

IAM intervention with TNF inhibitor restored PNCI in mice

基于已识别的微胶质细胞亚群和细胞间通讯模式，建立了假设的调节网络，显示IAM通过升高的TNF信号在启动炎症中起关键作用，从而影响星形胶质细胞反应和内皮功能障碍。透射电子显微镜显示手术后海马血管超微结构变化：内皮细胞出现明显的 cytoplasmic vacuolization 和基底膜碎片化，表明内皮屏障损伤。

选择临床可用的TNF抑制剂依那西普(etanercept)靶向IAM驱动的炎症。ELISA证实海马TNF-α水平在手术组显著增加，依那西普治疗后有效抑制。IF/FISH验证了调节网络主要功能基因的表达：炎症基因Tnf、Ccl2和Il1b在手术组海马小胶质细胞中显著上调，而TNF抑制剂将其表达降低至基线水平。免疫荧光证实TNF-α蛋白表达也在手术组小胶质细胞中增加，TNF抑制剂将其表达降低至基线。Egr1和C1qa在星形胶质细胞中显著上调，Icam1和Iftm3在手术组血管内皮细胞中显著上调，TNF抑制剂将其表达降低至基线。

通过Morris水迷宫(MWM)和恐惧条件测试(FCT)评估老年小鼠手术后和TNF抑制后的认知功能。在MWM测试中，逃避潜伏期在对照组随着训练进行显著减少，这种趋势在手术组不太明显，TNF抑制剂治疗可挽救这种缺陷。空间记忆通过平台穿越次数和在目标象限停留时间评估，手术后受损，TNF抑制剂治疗可挽救。在FCT中，海马依赖的情景记忆在手术后1天和5天显著受损，TNF抑制剂治疗挽救了这些情境认知障碍。对于海马非依赖的语调认知，两组方差分析显示治疗(依那西普vs盐水)和条件(对照vs手术)之间没有显著交互作用。

本研究提供了PNCI小鼠海马胶质和血管细胞群的单细胞图谱，揭示了八个微胶质细胞亚群。其中，扩增的IAM表现出与胶质细胞和内皮细胞增强的网络通讯，通过TNF介导的信号传导促进海马炎症。此外，TNF抑制减轻了术后微胶质细胞激活和认知障碍。这些发现突出了海马IAM作为PNCI预防和治疗的关键致病驱动因素和有前景的治疗靶点。

该研究的创新之处在于首次在围手术期背景下系统描绘了海马区微胶质细胞的异质性图谱，特别是发现了IAM这一关键亚群在PNCI中的核心作用。不同于神经退行性疾病中观察到的慢性激活，围手术期微胶质细胞激活是短暂而强烈的，术后24小时即观察到IAM增加。这种急性微胶质细胞激活可能启动长期的神经炎症和进行性神经元功能障碍，导致长期认知障碍。

研究还揭示了微胶质细胞、星形胶质细胞和内皮细胞共同构成胶质血管单元(GVU)，在神经退行性疾病进展中调节血脑屏障功能和CNS稳态中起着不可或缺的作用。在GVU内，微胶质细胞和星形胶质细胞与脑血管保持密切的空间接近。研究表明，术后IAM的扩增与星形胶质细胞和内皮细胞的通讯增强相关。IAM诱导反应性星形胶质细胞表型，进一步塑造炎症微环境。微胶质细胞和星形胶质细胞之间的双向相互作用，以及内皮功能障碍，形成维持神经炎症的病理循环。

该研究为PNCI的防治提供了新的思路和靶点。控制微胶质细胞激活和减轻CNS炎症已被确定为AD、缺血性中风和创伤性脑损伤的有前景的治疗策略。研究表明，靶向IAM通过TNF信号干预具有治疗潜力。临床试验也显示TNF抑制剂在AD患者中的安全性、耐受性和潜在认知益处。然而，这种干预仍然是超适应症使用，TNF抑制剂在PNCI和神经退行性疾病患者中的使用仍需进一步研究。

总之，这项研究不仅深化了对PNCI发病机制的理解，而且为开发针对特定微胶质细胞亚群的精准治疗策略提供了重要依据，具有重要的理论意义和临床转化价值。