脑肿瘤微环境中的微生物信号：原发性与转移性脑瘤的微生物组学研究

本研究针对脑肿瘤微环境(TME)中微生物信号的存在与功能这一争议性问题，通过多组学与空间技术联合分析，在胶质瘤和脑转移瘤中检测到细胞内细菌16S rRNA信号，发现其与抗菌反应、免疫代谢特征显著相关，并与口腔/肠道菌群存在序列重叠，为脑肿瘤微生物学研究提供了新范式。

当谈及脑肿瘤，特别是胶质母细胞瘤(GBM)和脑转移瘤(BrM)时，我们面临的是一类预后极差的疾病。尽管手术、放疗和系统治疗不断进步，但患者的生存率仍然不容乐观。这促使科学家们不断深入探索脑肿瘤微环境(TME)的复杂性，寻找新的治疗靶点。近年来，微生物组研究为肿瘤生物学带来了新的视角。微生物已被证明是肿瘤免疫的重要调节因子。然而，关于人类癌症中是否存在肿瘤类型特异性微生物组的问题，最近引发了激烈争论。特别是在脑肿瘤这种传统上被认为是"无菌"的器官中，微生物是否存在、如何分布以及具有怎样的生物学功能，这些都是悬而未决的科学问题。

在这项发表于《Nature Medicine》的前瞻性、多机构研究中，研究人员开展了一项系统性探索。他们整合了互补的实验和生物信息学方法，旨在验证微生物元素在脑肿瘤微环境中的存在、分布和生物学相关性。研究团队收集了来自221名患者的243个样本，包括168个胶质瘤和脑转移瘤样本以及75个非癌性或肿瘤邻近组织。

研究采用了严格的质量控制流程，通过荧光原位杂交(FISH)、免疫组化(IHC)和高分辨率空间成像技术，在胶质瘤和脑转移瘤样本中检测到细胞内细菌16S rRNA和脂多糖(LPS)信号。定制化的16S和宏基因组测序工作流程识别了与肿瘤内细菌信号相关的分类群，而标准培养方法未能获得易培养的微生物群。空间分析揭示了细菌16S信号与抗菌、免疫代谢特征在区域、邻域和细胞水平上的显著相关性。此外，肿瘤内16S细菌信号与匹配的口腔和肠道微生物组存在序列重叠，提示与远处微生物群落可能存在联系。

关键技术方法包括：RNAScope FISH和空间分子成像(SMI)用于细菌信号的检测和验证；培养组学和生物信息学分析用于肿瘤内细菌信号的分类学表征；空间技术用于评估肿瘤微环境中的生物学相关性。样本来自MD安德森癌症中心(MDACC)和德克萨斯大学健康科学中心(UTH)的前瞻性队列，包括胶质瘤、脑转移瘤和非癌性脑组织样本。

细菌16S信号在原发性与转移性脑肿瘤中的检测

研究人员首先在15个胶质瘤和15个脑转移瘤样本上进行了RNAScope FISH实验，使用经过验证的16S rRNA泛细菌探针。他们在11个胶质瘤和9个脑转移瘤中检测到明显的16S rRNA信号。z-stack成像显示16S rRNA信号靠近细胞核，提示细胞内定位。通过与胶质纤维酸性蛋白(GFAP)(胶质瘤)或泛细胞角蛋白(BrM)膜标记物共染色，揭示了细菌16S rRNA的多样化定位模式。

为了进一步研究细菌元素的存在，研究人员在连续组织切片上进行了脂多糖(LPS)染色。LPS在13个胶质瘤和9个脑转移瘤样本中被检测到，染色模式提示细胞内和细胞外定位。值得注意的是，16S rRNA FISH和LPS染色结果在30个样本中的22个具有一致性。

脑肿瘤与非癌性脑组织中的差异性细菌特征

为了进一步表征肿瘤内细菌信号，研究人员组装了来自MD安德森癌症中心和德克萨斯大学健康科学中心休斯顿分校的前瞻性胶质瘤和脑转移瘤样本队列，并使用16S(V3-V4)rRNA扩增子测序进行分析。通过五步过滤流程去除潜在污染物后，46.6%的肿瘤样本和76.9%的非癌性脑样本没有保留任何可检测的细菌信号。

在剩余的样本中，共鉴定出34个细菌分类群，其中16个与人类共生微生物群相关，代表潜在的生物学意义信号；而18个是已知的环境污染物。这些结果凸显了低生物量样本生物信息学分析的固有局限性。

16S高信号肿瘤区域富含抗菌特征

研究人员使用数字空间谱分析(DSP)检测了肿瘤内16S信号与脑肿瘤微环境中蛋白和转录特征的关系。DSP在先前描述的胶质瘤和脑转移瘤组织微阵列上进行，使用GeoMx免疫肿瘤蛋白组图谱(IPA)、全转录组检测(WTA)和定制泛细菌16S探针。

在胶质瘤和脑转移瘤的16S高信号肿瘤区域，研究人员鉴定出与抗菌反应相关的蛋白和转录本。在胶质瘤中，观察到损伤相关分子模式(DAMP)和Toll样受体(TLR)的蛋白富集。在脑转移瘤中，16S高信号区域显示出TLR9的蛋白富集，这是检测细胞内微生物核酸的关键模式识别受体(PRR)，以及TLR9下游经典通路的富集。

16S阳性肿瘤细胞和微环境呈现独特转录谱

研究人员进一步利用空间分子成像在单细胞和微环境水平验证了DSP的区域分析结果。在脑转移瘤中，通路评分在所有四位患者的合并16S阳性肿瘤细胞中显著较高，表明相关通路反映了一个协调的转录程序，而非孤立的基因水平变化。在个体患者水平，通路评分在至少三位患者中有显著差异，提示观察到的转录模式患者间变异性有限。

肿瘤内细菌16S信号与口腔和肠道微生物组的相关性

考虑到肠-口-脑轴的大量文献，研究人员分析了使用宏基因组鸟枪法测序的脑肿瘤患者的口腔和肠道微生物组。脑肿瘤相关的口腔和肠道微生物组与健康个体的微生物组在β多样性上存在显著差异，并且在脑肿瘤个体中鉴定出独特的口腔和肠道细菌特征。

有趣的是，几种脑肿瘤相关的口腔和肠道细菌分类群与使用16S扩增子或宏基因组测序鉴定的肿瘤内细菌分类群重叠。在34对肿瘤-唾液样本中，有11对发现了肿瘤细菌信号与唾液微生物组的重叠，平均79%的肿瘤中检测到的序列全长与唾液细菌序列重叠。

这项研究通过多组学整合分析，证实了细菌16S信号作为脑肿瘤微环境的一个组成部分，尽管仅在部分肿瘤样本中以低丰度存在。研究发现这些细菌信号与抗菌、免疫和代谢特征相关，并显示出与口腔和肠道微生物组的序列相似性。这些发现不仅为脑肿瘤微生物组研究提供了新的技术范式，也为理解微生物在脑肿瘤进展中的作用机制奠定了基础。

研究的局限性主要来自临床背景和相关分析的性质，以及相对于队列异质性的适中样本量，限制了我们全面评估肿瘤内细菌信号的生物学和临床意义的能力。然而，这些发现为未来研究指明了重要方向，包括确定16S信号向脑肿瘤转移的机制、它们在塑造肿瘤微环境中的因果作用，以及它们对脑肿瘤进展的影响。

这项研究的重要意义在于它为解决脑肿瘤微生物组研究中的技术争议提供了严谨的方法学框架，同时揭示了微生物元素在脑肿瘤微环境中的潜在生物学功能。随着多机构合作和标准化研究的推进，我们对脑肿瘤中微生物信号的理解将不断深化，最终可能为这种难治性疾病带来新的治疗策略。