靶向SERPINB3-MAPK轴逆转铜死亡耐药以增强胰腺癌免疫治疗疗效

本研究针对胰腺导管腺癌(PDAC)对新型细胞死亡方式——铜死亡(cuproptosis)产生耐药性及免疫抑制微环境形成的难题，揭示了SERPINB3通过抑制分子伴侣介导的自噬(CMA)降解MEK1，持续激活MAPK信号通路并下调FDX1转录，从而介导铜死亡耐药和免疫逃逸。研究人员开发了金属有机框架(MOF)纳米载体共递送MEK抑制剂(MEKi)和铜离子，在SERPINB3高表达PDAC模型中成功克服耐药性，联合PD-1抑制剂实现显著肿瘤抑制。该研究为PDAC提供了新的生物标志物和联合治疗策略。

胰腺癌，尤其是胰腺导管腺癌(PDAC)，是一种恶性程度极高、预后极差的消化道肿瘤，其五年生存率仅为13%。尽管手术、化疗和免疫检查点抑制剂等治疗方法不断进步，但晚期胰腺癌的治疗效果依然有限，患者生存期延长不明显。因此，探索新的肿瘤细胞死亡机制并开发相应的治疗策略，成为胰腺癌研究的重要方向。

近年来，一种新型的细胞死亡方式——铜死亡(cuproptosis)的发现，为肿瘤治疗带来了新的希望。铜死亡是由细胞内铜离子过度累积所触发，铜离子直接结合三羧酸循环中脂酰化的蛋白质，导致其异常寡聚化，进而引起铁硫簇蛋白丢失，最终诱导细胞死亡。理论上，增加细胞内铜离子浓度是诱导铜死亡最直接的方法。一些前期研究也表明，在胃癌细胞模型中，提高铜离子水平可以有效引发铜死亡。然而，铜死亡在胰腺癌中的作用及其调控机制尚不清楚。

有趣的是，本研究团队发现，与正常胰腺组织相比，PDAC组织中的铜离子浓度显著升高，肿瘤细胞表现出“铜富集”表型。这意味着胰腺癌细胞本身对铜死亡更为敏感，这似乎为利用铜死亡进行肿瘤选择性治疗提供了有利条件。然而，进一步的临床数据分析却出现了令人意外的结果：铜离子浓度高的PDAC患者，其肿瘤分期更晚、分化程度更差、更易发生淋巴结转移和远处转移，总体生存期(OS)和无病生存期(DFS)反而更短。这提示我们，尽管PDAC细胞积累了更多的铜，理应更容易发生铜死亡，但高度恶性的PDAC细胞可能发展出了抵抗铜死亡的机制，甚至利用这种“铜富集”状态促进肿瘤进展和免疫逃逸。

为了验证这一猜想，研究人员检测了不同分期PDAC肿瘤组织中铜死亡的关键执行指标——脂酰化蛋白和FDX1（ferredoxin 1）的表达水平。结果发现，随着肿瘤分期的进展，脂酰化蛋白和FDX1的表达逐渐降低。更重要的是，利用患者来源的类器官(PDO)模型进行药物敏感性测试发现，晚期（III/IV期）PDAC类器官对铜死亡诱导剂伊列斯莫醇-铜(ES-Cu)的半数抑制浓度(IC₅₀)显著高于早期（I期）类器官，明确证实了晚期PDAC存在铜死亡耐药。而且，这种耐药性与肿瘤分化差、远处转移和不良预后密切相关。虽然进一步提高ES-Cu的浓度可以在一定程度上杀死晚期肿瘤细胞，但高浓度也会对正常胰腺上皮细胞产生毒性，限制了其治疗窗口。因此，揭示PDAC细胞产生铜死亡耐药的内在机制，并寻找克服耐药的策略，对于开发有效的胰腺癌新疗法至关重要。

为了阐明铜死亡耐药的机制，研究团队进行了一系列深入的探索。他们通过对癌症基因组图谱(TCGA)中PDAC患者的转录组数据进行分析，并结合本中心收集的临床样本进行单细胞RNA测序(scRNA-seq)，通过多组学交叉分析，成功筛选出一个关键的候选基因——SERPINB3。SERPINB3是一种高度保守的半胱氨酸蛋白酶抑制剂。免疫组化(IHC)和蛋白质印迹(WB)结果证实，SERPINB3在PDAC组织中的表达显著高于正常组织，并且其高表达与肿瘤体积大、淋巴结转移、远处转移、晚期AJCC分期以及较差的OS和DFS显著相关。在PDO模型中，SERPINB3的表达水平与对ES-Cu的敏感性呈负相关。这些结果表明，SERPINB3是PDAC铜死亡耐药和肿瘤进展的关键生物标志物。

那么，SERPINB3是如何导致铜死亡耐药的呢？研究人员通过体外细胞实验发现，敲低SERPINB3能显著增强PDAC细胞对ES-Cu诱导的细胞死亡的敏感性，而过表达SERPINB3则产生明显的耐药性。进一步的机制研究表明，SERPINB3并不影响细胞内铜离子或谷胱甘肽(GSH)的水平，而是特异性地下调了铜死亡关键蛋白FDX1的转录水平。FDX1能将Cu²⁺还原为毒性更强的Cu⁺，并调控DLAT（dihydrolipoamide S-acetyltransferase）的脂酰化，其表达下调是导致铜死亡耐药的重要原因。挽救实验证实，敲低FDX1可以逆转因SERPINB3敲低而增强的铜死亡敏感性。然而，SERPINB3促进肿瘤增殖、迁移和侵袭的作用并不依赖于FDX1，提示SERPINB3通过不同的通路分别调控铜死亡敏感性和肿瘤恶性行为。

接下来，研究团队深入挖掘了SERPINB3调控FDX1的上游机制。RNA测序和KEGG通路富集分析显示，SERPINB3过表达主要激活了MAPK信号通路。磷酸化抗体芯片和WB实验证实，SERPINB3过表达显著增加了ERK的磷酸化水平以及其上游激酶MEK1的蛋白表达，而不影响MEK1的mRNA水平。这表明SERPINB3是在蛋白质层面稳定了MEK1。后续的蛋白降解动力学实验发现，SERPINB3通过抑制MEK1的溶酶体降解途径来稳定其蛋白水平。具体机制是：SERPINB3直接与MEK1结合，竞争性地阻断了MEK1与分子伴侣蛋白HSC70（70-kDa heat shock cognate protein）的相互作用，从而抑制了分子伴侣介导的自噬(CMA)对MEK1的降解。CMA是一种选择性溶酶体降解途径，能识别含有KFERQ样模序的蛋白质并将其降解。MEK1蛋白序列中存在三个经典的KFERQ样模序，是CMA的潜在底物。当SERPINB3高表达时，MEK1-HSC70相互作用减弱，MEK1无法被有效降解，导致MAPK信号通路持续激活。

激活的MAPK/ERK通路如何导致FDX1下调呢？研究人员发现，ERK的激活会促进其下游转录因子FOXO3从细胞核中排出并发生泛素化降解。染色质免疫共沉淀(ChIP)和双荧光素酶报告基因实验证实，FOXO3可以直接结合到FDX1基因启动子区的特定区域（-1215至-1222），正向调控FDX1的转录。因此，SERPINB3通过CMA-MEK1-MAPK/ERK轴抑制FOXO3的核定位，进而抑制FDX1的转录，最终导致铜死亡耐药。

除了介导铜死亡耐药，研究还发现SERPINB3高表达的肿瘤表现出PD-L1（CD274）表达上调，以及CD8⁺ T细胞浸润减少，形成了免疫抑制微环境。这部分作用也部分依赖于MAPK通路的激活，因为MEK抑制剂处理可以部分逆转SERPINB3驱动的PD-L1上调。然而，MEKi单药并不能完全恢复CD8⁺ T细胞对肿瘤细胞的杀伤能力，提示还存在其他免疫抑制通路。

基于上述机制，研究团队提出了一种联合治疗策略：同时靶向MAPK通路、诱导铜死亡并阻断PD-1/PD-L1免疫检查点。然而，传统的铜死亡诱导剂ES-Cu在体内，尤其是在原位胰腺肿瘤模型中，由于血浆半衰期短、组织渗透性差，其生物利用度有限，难以有效提高肿瘤内的铜浓度。为了解决这一难题，研究人员设计并合成了一种新型的金属有机框架(MOF)纳米材料——MOF-M-CuS_x。该纳米平台可以同时装载MEK抑制剂(MEKi)和铜离子(Cu²⁺)。MOF纳米颗粒具有高载药量、良好的稳定性和生物相容性，并且可以进行表面修饰实现靶向递送，在肿瘤微酸性环境中实现药物可控释放。实验证明，MOF-M-CuS_x能够有效富集到原位胰腺肿瘤中，显著提高肿瘤内的铜离子浓度。

在SERPINB3高表达的原位PDAC小鼠模型中，MOF-M-CuS_x单药治疗即可有效诱导肿瘤细胞发生铜死亡，并显著抑制肿瘤生长。更重要的是，MOF-M-CuS_x与抗PD-1抗体的三联疗法（MEKi + 铜死亡诱导 + aPD-1）展现了最强的抗肿瘤效果。该联合疗法不仅通过MEKi抑制MAPK通路、恢复铜死亡敏感性，还通过诱导铜死亡这种免疫原性细胞死亡(ICD)，增加了肿瘤内CD8⁺ T细胞的浸润和活化（表现为IFN-γ和颗粒酶B GZMB分泌增加），再联合PD-1阻断，进一步解除了T细胞的耗竭状态，从而实现了协同的肿瘤抑制和生存期延长。

本研究主要应用了以下关键技术：利用患者来源的类器官(PDO)模型进行药物敏感性筛选；通过转录组测序(RNA-seq)和单细胞RNA测序(scRNA-seq)进行生物标志物筛选和机制探索；采用蛋白质印迹(WB)、免疫荧光(IF)、免疫组化(IHC)和多色免疫荧光(mIFS)进行蛋白表达和定位分析；通过免疫共沉淀(Co-IP)、邻近连接 assay(PLA)和质谱(MS)分析蛋白质相互作用；利用染色质免疫共沉淀(ChIP)和双荧光素酶报告基因 assay 研究转录调控；构建皮下、肝转移和原位移植瘤小鼠模型进行体内药效评估；设计并合成金属有机框架(MOF)纳米材料用于药物递送。临床样本来源于福建医科大学附属临床医学院和福建医科大学附属协和医院的生物样本库。

研究结果

胰腺癌细胞表现出铜死亡敏感性但晚期产生耐药性

通过对43对PDAC组织及癌旁正常组织进行检测，发现PDAC组织中铜离子浓度显著高于正常组织。利用磁珠分选(MACS)从新鲜PDAC样本中分离EpCAM⁺肿瘤细胞和非肿瘤细胞，证实肿瘤细胞内铜离子浓度更高。体外实验显示ES-Cu能选择性诱导PDAC细胞死亡，且可被铜螯合剂TTM逆转。PDAC组织中脂酰化蛋白和FDX1水平也更高。然而，临床数据分析显示，高铜含量与更晚的AJCC分期、更差的肿瘤分化、淋巴结转移、远处转移以及更短的OS和DFS相关。PDO模型证实晚期PDAC对ES-Cu的IC₅₀更高，即产生铜死亡耐药。

SERPINB3是铜死亡耐药的关键调控因子

通过TCGA数据库分析、LASSO回归模型构建以及scRNA-seq数据交叉比对，筛选出SERPINB3作为关键候选基因。实验证实SERPINB3在PDAC中高表达，且与不良预后和铜死亡耐药正相关。SERPINB3高表达的肿瘤表现出CD8⁺ T细胞浸润减少和PD-L1表达上调。

SERPINB3赋予铜死亡耐药并促进肿瘤进展

功能实验表明，SERPINB3敲低增强ES-Cu敏感性，过表达则诱导耐药，且不影响铜稳态。SERPINB3过表达降低脂酰化DLAT水平和ES-Cu诱导的DLAT寡聚化。在无铜应激条件下，SERPINB3自身也能促进PDAC细胞增殖、迁移、侵袭和体内肝转移。

SERPINB3通过下调FDX1介导铜死亡耐药

SERPINB3特异性抑制FDX1的转录和蛋白表达，而不影响其他铜死亡相关基因(CRGs)。挽救实验证实FDX1敲低可逆转SERPINB3敲低导致的铜死亡增敏。但SERPINB3对肿瘤恶性行为的促进作用不依赖于FDX1。

SERPINB3通过激活MAPK信号通路诱导铜死亡耐药和肿瘤进展

RNA-seq和GSEA分析显示SERPINB3过表达激活MAPK通路。SERPINB3上调p-ERK和MEK1蛋白。MEKi处理可逆转SERPINB3介导的FDX1下调、铜死亡耐药以及肿瘤增殖和转移能力的增强。

SERPINB3介导的MAPK通路激活抑制FDX1转录

放线菌素D实验表明SERPINB3不影响FDX1 mRNA稳定性。筛选发现FOXO3是调控FDX1的关键转录因子。FOXO3直接结合FDX1启动子特定区域促进其转录。SERPINB3通过MAPK/ERK激活导致FOXO3核排出和降解，从而抑制FDX1转录。

SERPINB3通过抑制CMA途径介导的MEK1降解来激活MAPK通路

SERPINB3不改变MEK1 mRNA但稳定其蛋白。降解实验表明SERPINB3抑制MEK1的溶酶体降解而非泛素-蛋白酶体降解。在自噬缺陷细胞中，SERPINB3仍调控MEK1降解。机制上，MEK1是CMA底物，SERPINB3通过竞争性结合MEK1，阻碍其与HSC70相互作用，从而抑制CMA对MEK1的降解。

靶向SERPINB3-MAPK轴可克服铜死亡耐药

临床样本mIFS证实SERPINB3^low组p-ERK低、FOXO3和FDX1高。PDO和皮下移植瘤模型证明MEKi可恢复SERPINB3^hi PDAC对ES-Cu的敏感性。但在原位模型中，ES-Cu因递送效率差疗效有限。

新型MOF纳米载体有效递送铜离子和MEKi至原位胰腺肿瘤

研发了MOF-M-CuS_x纳米颗粒，可共载MEKi和Cu²⁺。该纳米粒能有效靶向原位胰腺肿瘤，提高瘤内铜浓度，在SERPINB3过表达原位模型中单药即能有效诱导铜死亡并抑制肿瘤生长，且无明显毒性。

SERPINB3通过上调PD-L1诱导免疫抑制

SERPINB3过表达上调PD-L1，且与CD8⁺ T细胞浸润负相关。scRNA-seq数据验证SERPINB3^hi组肿瘤细胞CD274(PD-L1)高表达，且效应T细胞减少、耗竭T细胞增加。MEKi部分逆转PD-L1上调。CD8⁺ T细胞杀伤实验表明，MEKi单药不能完全逆转SERPINB3驱动的免疫抑制，需联合抗PD-1。

铜死亡诱导联合抗PD-1疗法可进一步抑制SERPINB3^hi PDAC进展

在SERPINB3过表达原位C57BL/6模型中，MOF-M-CuS_x联合抗PD-1疗法展现出最强的抗肿瘤效果，显著增加瘤内CD8⁺ T细胞浸润、活化（IFN-γ⁺和GZMB⁺ T细胞比例增加），并显著延长小鼠生存期。

结论与展望

本研究系统揭示了SERPINB3在胰腺癌中的双重功能：一方面通过CMA-MEK1-MAPK-FOXO3-FDX1轴介导铜死亡耐药，另一方面促进肿瘤恶性进展和PD-L1介导的免疫逃逸。研究首次阐明了MAPK通路在铜死亡耐药中的上游调控作用，并创新性地开发了MOF纳米平台用于共递送MEKi和铜离子，克服了传统铜死亡诱导剂的药代动力学瓶颈。提出的“铜死亡增敏-免疫治疗唤醒”三联策略（MEKi + 铜死亡诱导 + aPD-1）为SERPINB3^hi胰腺癌这一难治亚型提供了极具前景的治疗新范式。

该研究将SERPINB3确立为预测胰腺癌铜死亡敏感性和指导个体化治疗的关键生物标志物。对于SERPINB3^low肿瘤，单用铜离子载体可能足够；而对于SERPINB3^hi肿瘤，则需采用联合策略。这项研究成功融合了金属生物学、纳米技术和免疫疗法，为克服胰腺癌的治疗耐药开辟了新的道路。未来，该联合策略的临床转化以及SERPINB3作为化疗敏感性预测标志物的潜力，值得进一步探索。