1 引言
急性呼吸窘迫综合征（ARDS）是心肺转流术（CPB）后常见的严重并发症，其显著特征为双侧肺浸润和严重低氧血症。肺缺血/再灌注损伤（LIRI）是CPB后发生早期肺损伤和ARDS的主要原因之一。LIRI破坏肺泡上皮细胞间的连接，促进肺白细胞浸润并损害肺泡上皮屏障（AEB）功能。尽管其临床意义重大，但LIRI的分子机制尚未完全阐明，且目前缺乏有效的药物治疗方案。
近期研究表明，心脏手术后血清游离脂肪酸（FFA）水平升高可能作为ARDS的预测标志物。脂质组学分析进一步揭示，LIRI响应下脂肪酸（FA）代谢发生显著改变，肺泡上皮细胞中出现明显的脂滴（LDs）积聚。虽然肺泡巨噬细胞中的LDs形成已成为肺部炎症的标志，但上皮细胞LDs积累的作用却被很大程度上忽视。脂肪酸结合蛋白4（FABP4）作为FABP家族成员，在脂质代谢和炎症中起关键作用。FABP4表达与循环FFA水平呈正相关，其抑制可减轻上皮细胞的炎症和凋亡。在癌症中，FABP4作为脂质介质促进不饱和FFA诱导的脂质积累并促进乳腺癌转移。然而，FABP4是否在肺损伤期间促进LDs积累和AEB破坏尚不清楚。
本研究通过建立体内外LIRI模型，探讨了FABP4在肺泡上皮损伤中的作用。单细胞转录组分析显示，FABP4是LIRI上皮细胞中持续上调的转录本。研究进一步阐明了FABP4介导的脂质代谢重编程如何促进EMT并损害AEB完整性。
2 结果
2.1 LIRI期间肺泡上皮细胞积累LDs
基于先前对FFA代谢的发现，研究人员探讨了LIRI期间肺泡上皮细胞内的LDs形成。采用小鼠肺门夹闭模型（1小时缺血后3小时再灌注）验证LIRI表型。透射电子显微镜显示肺泡上皮细胞中存在球形、电子透明的结构，后被鉴定为LDs。油红O染色显示LDs积累在再灌注1-3小时达到峰值，随后逐渐下降。体外实验中，MLE-12细胞经受缺氧/复氧（HR）处理后，尼罗红染色显示LDs呈时间依赖性增加。脂质组学表明中性脂质增加，主要是FFAs和甘油三酯（TGs），而非胆固醇酯（CEs）。使用LDs形成抑制剂Triacsin C可减轻LIRI诱导的小鼠肺损伤，并保留HR处理细胞中闭锁小带蛋白1（ZO-1）的表达，证明LDs积累是屏障功能障碍和肺损伤的原因之一。这些发现通过LIRI小鼠肺部的全面脂质组学分析得到证实。
研究人员进一步探讨了HR暴露上皮细胞中LDs生物发生的关键调节因子。在perilipin（PLIN）家族中，只有PLIN2在HR处理的MLE-12细胞中在mRNA和蛋白水平均一致上调。敲低PLIN2显著减少了LDs积累。为研究体内相关性，研究人员通过尾静脉注射递送表达上皮细胞特异性靶向PLIN2的shRNA（AAV-shPlin2）或乱序对照（AAV-shCtl）的高滴度腺相关病毒（AAV）。LIRI攻击后，经AAV-shPlin2处理的小鼠肺损伤减轻。这些结果共同证明LIRI诱导肺泡上皮细胞LD积累，其中PLIN2在介导LDs生物发生和导致肺损伤中起关键作用。
2.2 LDs促进AEB破坏
为研究LDs在HR诱导的肺泡上皮损伤中的作用，研究人员评估了MLE-12细胞的AEB功能。跨上皮电阻（TEER）测量显示HR暴露后屏障完整性显著降低。使用异硫氰酸荧光素（FITC）-葡聚糖的通透性测定显示HR条件下上皮通透性增加。FITC-葡聚糖渗透可视化证实了屏障泄漏增强。为确定LDs对此屏障破坏的贡献，研究人员敲低了LDs形成的关键调节因子PLIN2。PLIN2沉默显著减弱了HR下的FITC-葡聚糖通透性，表明屏障完整性改善。考虑到紧密连接在维持上皮屏障功能中的重要作用，研究人员评估了关键紧密连接蛋白ZO-1的表达。HR暴露导致ZO-1下调和连接破坏，而PLIN2敲低恢复了ZO-1表达并保留了细胞间接触。
随后，研究人员在体内LIRI模型中验证了这些发现。伊文思蓝染料外渗显示AAV-shPlin2显著降低了肺血管渗漏。紧密连接蛋白的Western blot分析进一步支持了这些观察结果：LIRI显著降低了AAV-shCtl肺中ZO-1、occludin和claudin-3的表达，而PLIN2敲低保留了它们的表达。这些数据共同证明PLIN2介导的LDs积累损害AEB完整性，抑制LDs形成可减轻HR和LIRI诱导的上皮屏障破坏。
2.3 FABP4信号驱动LDs形成和AEB破坏
为探索调节LDs积累和上皮屏障破坏的上游机制，研究人员对LIRI小鼠的肺组织进行了单细胞RNA测序（scRNA-seq）。共分析了44,152个细胞，并根据LungMAP和ImmGen数据库的已知标志物将其聚类为不同的细胞类型。在脂质代谢相关的转录本中，研究人员鉴定出Fabp4，其编码FABP4，一种已知在FA摄取、转运和代谢中发挥作用的胞浆伴侣蛋白。FABP4 mRNA在LIRI肺组织和HR暴露的MLE-12细胞中均显著增加。蛋白质分析进一步证明在HR条件下和LIRI肺中，细胞内和分泌的活性FABP4水平增加。在人气道小上皮细胞（HSAEpiC）上进行HR处理也观察到FABP4表达的类似上调。肺组织中FABP4表达在再灌注后1-3小时达到峰值，反映了LDs积累的时间模式。此外，批量RNA-seq分析表明MAPK和紧密连接通路在FABP4信号下游被激活。在功能上，HR刺激的MLE-12细胞中敲低FABP4显著减少了LDs积累并恢复了ZO-1表达，表明对屏障完整性有保护作用。为评估体内效应，研究人员给予上皮特异性AAV-shFabp4。两个独立的靶向FABP4的shRNA序列均有效降低了FABP4表达，并保留了肺泡超微结构。此外，FABP4敲低显著减轻了LIRI小鼠的肺泡上皮损伤和肺通透性。ELISA分析显示AAV-shFabp4显著降低了LIRI诱导的肺组织中促炎细胞因子IL-6和TNF-α的升高，证明FABP4在LIRI期间促进炎症反应。重要的是，用MAPK激动剂处理逆转了FABP4敲低的保护作用，恢复了LDs积累和屏障功能障碍，凸显了FABP4-MAPK信号在此过程中的重要性。这些发现共同证明FABP4通过激活MAPK信号促进LDs形成并导致AEB破坏。
2.4 FABP4介导的脂噬促进FA代谢和TG形成
为探讨FABP4在肺代谢中的作用，研究人员聚焦于scRNA-seq数据集中的上皮细胞簇。基因集富集分析（GSEA）显示，LIRI与假手术组之间差异表达基因（DEGs）在FA代谢通路中显著富集。随后进行的脂质组学分析以探索潜在机制。LIRI与假手术肺组织之间的差异脂质代谢物分析鉴定出几个显著改变。热图进一步展示了这些代谢物的聚类和表达模式。京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析强调FA代谢失调是LIRI诱导损伤的潜在关键因素。正如预期，脂质组学分析显示LIRI小鼠肺组织中中性脂质净增加，特别是FAs形式。在LIRI小鼠的血清样本中也观察到类似的积累。值得注意的是，通过AAV-shFabp4降低LIRI小鼠的FABP4表达显著降低了FAs浓度，证实了FABP4在调节LIRI期间FA水平中的关键作用。
研究人员接下来检验了MAPK信号（被鉴定为FABP4介导的LDs积累的上游调节因子）是否也影响FA代谢。虽然总MAPK蛋白表达未观察到变化，但检测到LIRI肺组织中p38 MAPK磷酸化显著增加。相反，AAV-shFabp4处理降低了p38 MAPK磷酸化水平，而ERK和JNK MAPKs的磷酸化状态保持不变，表明FABP4介导的效应是特异性通过p38 MAPK通路而非其他MAPK家族成员介导的。此外，MLE-12细胞中的免疫共沉淀（Co-IP）实验证实FABP4在HR处理的细胞中与p38 MAPK发生物理相互作用。为验证体内p38 MAPK的功能重要性，研究人员用茴香霉素处理AAV-shFabp4小鼠。茴香霉素逆转了FABP4敲低的保护作用，证实p38 MAPK对FABP4介导的肺损伤至关重要。
考虑到p38 MAPK在调节ULK1（自噬和脂噬的关键调节因子）中的作用，研究人员假设FABP4激活的p38 MAPK促进ULK1 Ser757位点磷酸化，这是一个抑制自噬的位点。确实，在LIRI肺组织和HR刺激的MLE-12细胞中均观察到ULK1磷酸化（Ser757）显著上调。这种上调被FABP4敲低所阻止，提示FABP4在调节ULK1激活中的作用。为确认靶点特异性，研究人员使用重组FABP4蛋白进行挽救实验。在sh-Fabp4细胞中重新表达FABP4恢复了p38磷酸化和ULK1磷酸化，证实这些效应是特异性由FABP4介导的。进一步实验证明，MLE-12细胞的HR处理导致PLIN2+细胞显著增加（LD形成的标志），同时LC3B斑点（自噬体形成的指标）减少和SQSTM1斑点（自噬降解的标志）增加，与脂噬抑制一致。然而，FABP4敲低逆转了这些变化，促进了LC3B斑点的形成并减少了SQSTM1斑点，表明脂噬增强。Western blot证实HR降低了LC3-II/LC3-I比率并增加了p62积累，这些被FABP4敲低所恢复。此外，Triacsin C处理在HR条件下独立地增加了LC3-II/LC3-I比率并降低了p62，证明即使不操作FABP4，LD减少也能促进自噬。为进一步验证这些发现，研究人员用p38 MAPK抑制剂SB202190处理MLE-12细胞。该处理不仅降低了ULK1磷酸化并促进了脂噬，而且还减少了LDs积累，为p38 MAPK参与FABP4介导的LDs形成提供了有力证据。总之，这些数据表明FABP4通过p38 MAPK依赖性脂噬促进LDs积累，从而调节FA代谢并促进LIRI期间的TG形成。
2.5 EMT受FABP4刺激的LDs积累调控
研究人员接下来探讨了FABP4驱动的LDs积累是否是HR条件下AEB破坏的先决条件。鉴于FABP4在促进EMT中的已知作用，研究人员首先评估了MLE-12细胞中的EMT标志。HR暴露导致上皮标志物E-钙黏蛋白显著减少和间质标志物波形蛋白增加。研究人员通过分析一组标志物进一步证实了HR下的EMT进展：间质特征包括N-钙黏蛋白、波形蛋白和Snail上调，而上皮标志物如ZO-1和E-钙黏蛋白下调。重要的是，敲低FABP4逆转了HR下MLE-12细胞的EMT表型。在功能上，划痕实验显示HR显著增强细胞迁移，而FABP4敲低显著抑制了迁移，证实FABP4介导的EMT促进细胞运动。用BMS309403进行FABP4药理抑制验证了这些发现，逆转了HR诱导的间质标志物上调，从而强化了FABP4在介导EMT中的作用。为验证EMT是否直接驱动屏障破坏，研究人员在HR暴露前用选择性EMT抑制剂ML-327处理MLE-12细胞。ML-327显著保留了ZO-1表达和紧密连接完整性，证明抑制EMT可防止屏障功能障碍。
为建立LDs积累与EMT之间的联系（两者均由HR驱动的FABP4信号促进），研究人员进行了具有全面对照的挽救实验。MLE-12细胞感染sh-Ctl或sh-Fabp4慢病毒，伴有或不伴有PLIN2过表达，并接受HR处理。HR在sh-Ctl细胞中诱导了强大的LDs形成，这被FABP4敲低所阻止。单独在sh-Ctl细胞中过表达PLIN2而无HR并未显著增加LDs，表明PLIN2需要脂质底物来促进LDs形成。重要的是，在sh-Fabp4细胞中过表达PLIN2在HR条件下恢复了LDs形成。与LDs恢复一致，HR下sh-Fabp4细胞中PLIN2过表达增加了脂噬损伤，重新激活了EMT标志物并破坏了紧密连接完整性。这证明FABP4下游的LDs积累足以驱动病理性上皮重塑。研究人员假设增加的LDs积累和EMT共同导致AEB功能障碍。使用上皮特异性AAV-shFabp4和AAV-Plin2-OE载体在小鼠中证明，AAV-Plin2-OE显著加剧了AAV-shFabp
