文章内容归纳总结
1 有氧糖酵解促进HCC的仑伐替尼耐药
为了探究仑伐替尼耐药（LR）的机制，研究人员首先对公共数据集GSE211850进行了分析。差异基因表达和基因本体富集分析显示，糖酵解和糖异生信号通路是LR表型中富集的关键KEGG通路。基因集富集分析也表明，LR与HCC中的乳酸生成相关。为了验证这一假设，研究团队建立了LR HCC细胞系（Huh7和Hep3B）。IC50 测定证实，与亲代细胞相比，LR细胞对仑伐替尼的耐药性显著更高，且仑伐替尼诱导的细胞凋亡显著减少，成功构建了LR模型。
有氧糖酵解以葡萄糖摄取和乳酸产生增加为特征，与靶向治疗耐药有关。研究人员检测了亲代和LR细胞中的ATP水平、葡萄糖摄取和细胞外乳酸水平。结果显示，LR细胞表现出更高的ATP水平、增加的葡萄糖消耗和升高的乳酸产量。Seahorse分析进一步揭示了LR细胞具有增强的细胞外酸化率（ECAR），包括基础糖酵解和糖酵解能力，表明糖酵解增强是LR的共同特征。
醛酮还原酶（AKRs）是催化辅因子依赖性氧化还原反应的胞质酶。为了探索它们在LR中的潜在作用，研究人员重新分析了GSE211850数据，比较了亲代和LR Huh7细胞中AKRs的表达。结果显示，LR细胞中AKR7A3、AKR1C3、AKR1B10和AKR1D1的mRNA表达显著更高。通过整合GTEx和TCGA的转录组数据，研究人员分析了14种AKRs在25种肿瘤类型中的表达谱。AKRs在大多数消化系统肿瘤中特异性升高，尤其是在HCC和胆管癌（CHOL）中，且通常高于正常组织，表明AKRs可能作为启动癌基因促进肿瘤进展。
为了评估AKRs在HCC中的诊断潜力，ROC分析显示，只有AKR1B10和AKR1C3的曲线下面积（AUC）值≥0.8，表明具有良好的诊断价值。单变量Cox分析确定，只有AKR1B10和AKR1C3是HCC患者总生存期（OS）、无进展生存期（PFS）和无病生存期（DFS）较差的统计学显著风险因素。公共蛋白质组学数据分析证实，与癌旁组织相比，HCC组织中AKR1B10和AKR1C3的蛋白水平显著更高。单细胞RNA测序数据（GSE166635）的重新分析显示，AKR1B10在肝细胞中的表达高于AKR1C3，且大多数AKRs主要在肝细胞中表达。相关性分析揭示了AKR1B10表达与糖酵解基因集富集分数之间存在显著的正相关，表明其参与了HCC的糖酵解过程。HCCDB数据库中14个HCC数据集的分析一致显示，HCC中AKR1B10 mRNA表达显著高于癌旁组织。空间转录组学数据（HCCDB）也证实，与癌旁区域相比，肿瘤区域中AKR1B10的表达普遍更高。关键的是，qRT-PCR和Western blot验证了LR细胞中AKR1B10的mRNA和蛋白水平显著高于亲代细胞。因此，研究人员将AKR1B10确定为候选基因，以进一步研究其在LR中的功能作用。
2 AKR1B10通过有氧糖酵解介导仑伐替尼耐药
为了确认AKR1B10在HCC LR进展中的刺激作用，研究人员在Huh7和Hep3B LR细胞系中稳定敲低了AKR1B10。qRT-PCR和Western blot证实了敲低效率。正如预期的那样，抑制AKR1B10显著增强了仑伐替尼敏感性，表现为LR细胞的IC50 值降低和细胞凋亡增加。与此一致的是，在LR细胞中敲低AKR1B10降低了细胞ATP水平、葡萄糖摄取和细胞外乳酸水平，表明有氧糖酵解受到抑制。Seahorse分析进一步揭示了敲低AKR1B10后ECAR降低，包括基础糖酵解和糖酵解能力。
相反，研究人员在亲代HCC细胞中稳定过表达了AKR1B10，qRT-PCR和Western blot验证了过表达效率。过表达AKR1B10显著增加了IC50 值，并减少了仑伐替尼诱导的细胞凋亡。值得注意的是，稳定表达AKR1B10通过增加细胞ATP水平、葡萄糖摄取、细胞外乳酸水平和糖酵解能力，增强了HCC细胞的有氧糖酵解。这些发现表明，AKR1B10促进LR并调节HCC的有氧糖酵解。
为了进一步阐明有氧糖酵解是否对AKR1B10介导的LR至关重要，研究人员用糖酵解抑制剂2-DG处理细胞。添加2-DG部分逆转了AKR1B10过表达所赋予的增强的LR，降低了IC50 值并增加了细胞凋亡。此外，2-DG抵消了AKR1B10过表达对有氧糖酵解的刺激作用，降低了ATP水平、葡萄糖摄取和乳酸产生。相反，糖酵解激活剂鱼藤酮增加了AKR1B10敲低细胞的IC50 值并减少了细胞凋亡。此外，鱼藤酮部分挽救了AKR1B10敲低对有氧糖酵解的抑制作用。这些结果表明，AKR1B10至少部分通过调节有氧糖酵解来促进LR。
3 Lys173位点的乳酸化修饰增强AKR1B10蛋白表达
研究人员接下来研究了LR细胞中AKR1B10蛋白表达显著升高的机制。他们首先考虑了基因组改变。然而，对TCGA队列中AKR1B10基因的体细胞拷贝数变异分析显示，这些事件与AKR1B10 mRNA水平之间没有相关性。由于蛋白质水平也可以通过翻译后修饰（PTMs）进行调节，并且考虑到LR、乳酸和乳酸化相关基因特征之间的关联，以及细胞内乳酸驱动赖氨酸乳酸化（Kla）的已知作用，研究人员假设乳酸化可能在仑伐替尼耐药的HCC中被激活。
Western blot分析证实，与亲代细胞相比，LR细胞系中的全赖氨酸乳酸化（pan-Kla）水平更高。随着仑伐替尼治疗时间的延长，pan-Kla水平进一步增加。研究人员收集了部分缓解（PR）和疾病进展（PD）患者的样本各4例。使用pan-Kla抗体进行免疫沉淀和Western blot检测，检测到了AKR1B10和乳酸化的AKR1B10。PD样本中的AKR1B10蛋白水平和乳酸化水平显著高于PR样本。一致地，LR细胞中的AKR1B10乳酸化也高于亲代细胞。值得注意的是，在表达Flag-AKR1B10的HCC细胞中，shRNA介导的AKR1B10敲低显著降低了AKR1B10乳酸化水平。
为了鉴定特异的乳酸化位点，质谱分析揭示了AKR1B10氨基酸序列中Lys173（K173）处存在单个赖氨酸乳酸化位点。K173在从褐家鼠到智人的物种中高度保守。研究人员将AKR1B10 K173突变为精氨酸（R）（AKR1B10 K173R）以模拟非乳酸化状态，并在HCC细胞中表达了Flag标记的突变体。免疫沉淀证实，K173R突变消除了AKR1B10的乳酸化。用乳酸钠（Nala）处理以浓度依赖性和时间依赖性方式增强了Flag-AKR1B10的乳酸化。相反，Nala处理并未增加Flag-AKR1B10 K173R的乳酸化。
研究人员随后探讨了乳酸化是否调节AKR1B10蛋白表达。与野生型Flag-AKR1B10不同，Flag-AKR1B10 K173R并未显著增加HCC细胞中的AKR1B10蛋白水平。此外，在稳定表达AKR1B10 shRNA的LR HCC细胞中，野生型Flag-AKR1B10，而非Flag-AKR1B10 K173R，以剂量依赖性方式显著增加了AKR1B10蛋白表达。在功能上，与野生型AKR1B10不同，Flag-AKR1B10 K173R未能增强对仑伐替尼的耐药性，IC50 值或细胞凋亡率均无变化。由于AKR1B10是一种关键的醛糖还原酶，研究人员假设其乳酸化状态可能通过调节其酶活性来影响HCC的葡萄糖代谢。为了验证这一点，研究人员评估了不同乳酸化水平下AKR1B10的活性。ELISA结果表明，野生型AKR1B10过表达增强了其分泌；然而，K173R突变体未能产生成熟且稳定的蛋白质。通过比较上清液中NADPH在340 nm处的消耗量（相对于AKR1B10分泌水平）来评估归一化酶活性，发现K173位点的突变并未显著改变AKR1B10的酶活性。这些数据表明，AKR1B10在Lys173位点发生乳酸化，这对于维持其蛋白质稳定性和促进LR表型至关重要。
4 AARS1与AKR1B10相互作用并使其乳酸化
为了鉴定负责利用乳酸和ATP催化AKR1B10乳酸化的乳酸转移酶，研究人员筛选了几种已建立的乳酸转移酶，包括KAT5、KAT8、AARS1和AARS2。TCGA HCC队列中mRNA表达水平的相关性分析显示，只有AARS1与AKR1B10表现出强正相关。免疫共沉淀（Co-IP）和Western blot证明，过表达AARS1增加了HCC细胞中AKR1B10的蛋白水平和乳酸化水平。相反，shRNA介导的AARS1抑制降低了AKR1B10蛋白和乳酸化水平。此外，siRNA敲低已报道的乳酸转移酶KAT5或KAT8并未抑制AKR1B10 Lys173的乳酸化，表明这两种酶均不催化这种特异性修饰。生存分析确定AARS1是HCC患者OS、PFS和DFS较差的显著风险因素。差异表达分析显示，与癌旁组织相比，大多数肿瘤类型（包括HCC）中AARS1 mRNA水平更高。HCCDB数据库的空间转录组学数据证实，与癌旁区域相比，肿瘤区域中AARS1的表达相对较高。
293T细胞中的Co-IP实验表明，重建的Flag-AKR1B10与HA标记的AARS1直接相互作用。Flag-AKR1B10 K173R也能下拉HA-AARS1，表明K173突变本身不会破坏AKR1B10-AARS1的结合。内源性Co-IP证实了HCC细胞中AARS1和AKR1B10之间的关联。这些结果确立了AARS1是一种与AKR1B10相互作用的蛋白质。
研究人员接下来研究了AARS1是否介导AKR1B10乳酸化和稳定性。根据报道，AARS1催化口袋残基（R77A, M100A, W176E, V218D, D239A；表示为AARS1-5 M）的突变会破坏乳酸结合，研究人员构建了HA标记的AARS1-5 M突变体。与野生型HA-AARS1不同，HA-AARS1-5 M未能增强AKR1B10乳酸化。一致地，只有野生型HA-AARS1，而非HA-AARS1-5 M，在Nala处理下乳酸化了Flag-AKR1B10。此外，虽然HA-AARS1增加了表达Flag-AKR1B10细胞中的乳酸化，但Flag-AKR1B10 K173R未显示这种增加，支持了AARS1介导的Lys173乳酸化对于AKR1B10蛋白积累至关重要的假设。
为了绘制特异的结合界面，分子对接分析预测了潜在的相互作用位点：AKR1B10残基Y295-V297与AARS1残基G456-G458，以及AKR1B10残基A744-K747与AARS1残基T4-L7。值得注意的是，AKR1B10的Lys173在空间上靠近AARS1的催化口袋，使其处于有利的乳酸化催化位置。使用各种突变构建体的体外Co-IP显示，两个预测的结合界面独立地促进了AKR1B10-AARS1相互作用。免疫荧光证实了AARS1-AKR1B10相互作用及其在细胞质中的共定位。
5 AARS1依赖的Lys173乳酸化抑制K63多聚泛素化介导的AKR1B10降解
赖氨酸是蛋白质结构和功能所必需的残基，会经历各种PTMs。值得注意的是，赖氨酸乳酸化已被报道可抑制蛋白质泛素化和随后的蛋白酶体降解。因此，研究人员接下来研究了AKR1B10在Lys173位点的乳酸化调节其HCC细胞中蛋白水平的机制。
首先，研究人员用蛋白酶体抑制剂MG132处理HCC细胞。正如预期的那样，MG132处理以时间依赖性方式增加了内源性AKR1B10的表达。此外，MG132有效消除了由AARS1沉默诱导的AKR1B10加速降解。此外，CHX追踪实验表明，沉默AARS1显著缩短了AKR1B10蛋白的半衰期，而过表达HA-AARS1（而非催化失活的突变体HA-AARS1 5 M）延长了其半衰期。
根据从PhosphoSitePlus数据库检索的数据，研究人员注意到之前已有报道称AKR1B10的Lys173位点发生泛素化。研究人员随后检测了AARS1介导的AKR1B10乳酸化是否调节其泛素化。使用泛素化阶梯分析，研究人员观察到AKR1B10 K173R突变体的泛素化水平明显高于野生型AKR1B10。一致地，AARS1沉默显著增加了野生型AKR1B10的多聚泛素化水平，但对AKR1B10 K173R突变体没有影响。类似地，糖酵解抑制剂2-DG显著增强了HCC细胞中内源性AKR1B10的多聚泛素化。相反，异位表达AARS1显著降低了野生型AKR1B10的多聚泛素化，但对K173R突变体没有影响，并且这种降低被2-DG逆转。同时，过表达野生型AARS1（具有乳酸转移酶活性），而非HA-AARS1 5 M，显著抑制了AKR1B10多聚泛素化。此外，AARS1过表达特异性抑制了K63连接的多聚泛素化，但不抑制K6-、K29-或K48连接的多聚泛素化。相反，AARS1沉默显著促进了K63连接的多聚泛素化。
研究人员随后将感染了表达Flag标记的野生型AKR1B10或AKR1B10 K173R突变体的慢病毒的Huh7细胞皮下注射到无胸腺裸鼠体内。所有肿瘤均用仑伐替尼治疗。与体外数据一致，表达野生型AKR1B10的异种移植物对仑伐替尼的敏感性显著低于表达K173R突变体的异种移植物。异种移植物的免疫组织化学（IHC）染色显示，携带野生型AKR1B10的肿瘤中AKR1B10表达强烈，表明K173R突变体在体内未能维持AKR1B10蛋白水平。这些结果共同表明，Lys173位点的乳酸化阻止了多聚泛素化介导的AKR1B10蛋白降解，从而增加了其蛋白水平。
6 Lys173乳酸化的AKR1B10促进LDHA磷酸化并通过促进组蛋白乳酸化增加LDHA的转录水平
为了进一步研究AKR1B10在有氧糖酵解中的特定生物学功能，研究人员对人HCC细胞中AKR1B10免疫沉淀物进行了质谱分析。结果显示，AKR1B10与乳酸脱氢酶A（LDHA）和乳酸脱氢酶B（LDHB）相互作用，这两种酶是催化丙酮酸转化为乳酸的已知酶。单细胞RNA测序数据（GSE166635）的分析令人惊讶地显示，LDHA mRNA表达在肝细胞中明显高于LDHB，而LDHB在肝细胞中表达极少。HCCDB的空间转录组学数据进一步证明，在HCC细胞内，LDHA表达水平显著高于LDHB，而LDHB主要在肿瘤微环境的免疫细胞中表达。因此，选择LDHA作为AKR1B10的候选相互作用伙伴和效应分子进行后续研究。正如预期的那样，内源性蛋白质的Co-IP证实了HCC细胞中AKR1B10和LDHA之间的关联。免疫荧光测定证实了这种直接相互作用，显示两种蛋白质在细胞质中共定位。
为了鉴定特异的结合位点，研究人员使用Discovery Studio模拟了AKR1B10-LDHA相互作用。预测的结构表明，AKR1B10的K169与LDHA的H181之间，以及AKR1B10的P189与LDHA的E313之间存在潜在的结合位点。使用突变构建体的体外Co-IP实验进一步证明，AKR1B10和LDHA上的这些特定残基对于它们的相互作用是不可或缺的。
鉴于LDHA酶活性受Tyr10（Y10）位点磷酸化的调节，该磷酸化促进四聚化并增强NADH结合，研究人员注意到模型中AKR1B10 K173与LDHA Y10在空间上接近。这表明AKR1B10 K173可能调节LDHA Y10磷酸化。有趣的是，过表达野生型AKR1B10，而非AKR1B10 K173R突变体，强烈增强了LDHA Y10磷酸化。此外，AKR1B10过表达增加了LDHA Y10磷酸化水平，而其抑制则降低了该水平。研究人员观察到AKR1B10表达水平也影响了总LDHA蛋白水平，表明AKR1B10可能调节LDHA mRNA表达或蛋白质稳定性。GSE211215数据分析显示，抑制AKR1B10下调了LDHA和LDHB mRNA水平。一致地，在LR细胞中敲低AKR1B10降低了LDHA mRNA，而在HCC细胞中过表达AKR1B10则增加了LDHA mRNA。
鉴于肿瘤微环境中的高乳酸水平，研究人员假设LDHA mRNA上调可能由组蛋白乳酸化介导。然而，mRNA稳定性测定表明，AKR1B10不影响LDHA mRNA稳定性。ChIP-seq数据（GSE156674）的重新分析表明，LDHA启动子区域可能受组蛋白H3赖氨酸18乳酸化（H3K18la）的调节。支持这一点的是，LDHA mRNA水平被糖酵解（从而乳酸产生）抑制剂2-DG下调，并通过添加鱼藤酮上调。使用六对引物跨越LDHA启动子的ChIP-qPCR测定证实了H3K18la在该位点的显著富集。此外，AKR1B10抑制减弱了LDHA启动子处的H3K18la富集，而稳定过表达AKR1B10则增强了这种富集。这些结果确立了H3K18la正向调节LDHA转录。
7 LDHA-Y10位点的磷酸化对于AKR1B10介导的HCC仑伐替尼耐药至关重要
为了从功能上确定LDHA Y10磷酸化对AKR1B10的必要性，研究人员在特定的HCC细胞模型中进行了拯救实验，调节LDHA表达和磷酸化。
首先，研究人员在稳定过表达AKR1B10的HCC细胞中使用shRNA敲低了LDHA表达。qRT-PCR和Western blot证实了有效的LDHA沉默，导致LDHA蛋白和LDHA Y10磷酸化水平降低。值得注意的是，LDHA敲低也降低了AKR1B10表达，表明这些蛋白质之间可能存在正反馈环。正如预期的那样，抑制LDHA显著增加了AKR1B10过表达细胞对仑伐替尼的敏感性，表现为IC50 值降低和细胞凋亡增加。一致地，LDHA敲低减弱了AKR1B10介导的有氧糖酵解增强，降低了细胞ATP水平、葡萄糖摄取、细胞外乳酸产生以及ECAR，包括基础糖酵解和糖酵解能力。
接下来，在稳定抑制AKR1B10的LR细胞中，研究人员重新引入了野生型LDHA或磷酸化缺陷突变体LDHA Y10A。Western blot验证了成功表达。与野生型LDHA不同，重新表达LDHA Y10A未能挽救LR，IC50 值或细胞凋亡率均无显著变化。在功能上，野生型LDHA恢复了细胞ATP水平、葡萄糖摄取和乳酸产生，而LDHA Y10A没有效果，证明Y10磷酸化对于AKR1B10的促糖酵解效应至关重要。Seahorse分析证实，在AKR1B10敲低的LR细胞中，过表达LDHA Y10A未能恢复ECAR、基础糖酵解或糖酵解能力。这些数据表明，LDHA在Y10位点的磷酸化对于维持其有氧糖酵解中的酶活性以及促进AKR1B10介导的LR表型至关重要。
为了评估AKR1B10-LDHA轴在LR中的临床相关性，研究人员分析了治疗后手术HCC样本中它们的表达和共定位。免疫荧光染色显示，与高表达的患者相比，AKR1B10和LDHA水平低的患者对仑伐替尼的反应更好（荧光强度降低更大）。两种蛋白质主要在细胞质中共定位。为了进一步评估AKR1B10作为潜在的HCC生物标志物，对161份HCC标本进行了免疫组织化学染色。根据免疫反应性将样本分为低、中或高AKR1B10表达，并且癌旁非肿瘤组织中的AKR1B10表达显著低于HCC组织。此外，来自PD患者的组织比来自PR患者的组织表现出更高的AKR1B10表达。生存分析表明，具有较高AKR1B10蛋白水平的患者OS和PFS显著缩短，表明AKR1B10可能作为仑伐替尼反应的预测因子和预后风险因素。
8 靶向AKR1B10-LDHA轴可提高仑伐替尼在HCC中的疗效
根据之前的报道，依帕司他（EPA）是AKR1B10的抑制剂，在多种癌症类型中抑制其分泌和酶活性。因此，本研究旨在验证EPA对AKR1B10的抑制作用，并探索其在HCC中与仑伐替尼的潜在协同抗癌作用。
在体外，EPA与仑伐替尼联合使用，在亲代HCC细胞和LR细胞中均诱导了比仑伐替尼单药治疗显著更高的细胞凋亡率，表明具有协同抗癌作用。为了进一步评估体内的治疗协同作用，研究人员将LR Huh7细胞皮下接种到无胸腺裸鼠体内。同时用EPA和仑伐替尼治疗的肿瘤表现出比任一单药治疗组显著更好的反应。与此一致的是，与单药治疗组相比，联合治疗导致个体小鼠的肿瘤重量和体积从基线水平显著减少。这些肿瘤的免疫组织化学分析证实，联合治疗显著降低了AKR1B10和LDHA的表达。
为了证实这些发现，研究人员建立了一个仑伐替尼耐药的小鼠Hepa1-6（Hepa1-6 LR）细胞系。验证包括对仑伐替尼的更高IC50 值和增加的pan-Kla水平，与亲代细胞相比。Western blot和免疫沉淀分析进一步显示，Hepa1-6 LR细胞中AKR1B10、LDHA、LDHA Y10磷酸化和AKR1B10乳酸化上调。与Huh7模型相似，EPA-仑伐替尼联合治疗在携带Hepa1-6 LR肿瘤的小鼠中引发了显著优于单药治疗的抗肿瘤反应，伴随着肿瘤重量和体积的显著更大减少。IHC再次证明联合治疗组中AKR1B10和LDHA表达显著降低。
为了进一步研究AKR1B10在LR中的作用和治疗潜力，研究人员利用了从仑伐替尼耐药的HCC患者建立的PDX模型。用EPA-仑伐替尼联合治疗的PDX模型比用载体、单用EPA或单用仑伐替尼治疗的模型长出显著更小和更轻的肿瘤。此外，携带肿瘤的小鼠接受EPA单药治疗或联合治疗并未显示任何体重减轻，而在未治疗或单用仑伐替尼的肿瘤小鼠中观察到这种效应。值得注意的是，接受单药治疗或联合治疗的小鼠未表现出肝或肾副作用。一致地，Western blot和免疫沉淀分析表明，与单药治疗相比，联合治疗显著抑制了AKR1B10乳酸化和LDHA Y10磷酸化。免疫荧光染色证实，在LR PDX肿瘤内，联合治疗组中AKR1B10和LDHA蛋白水平均下调。这些结果共同表明，EPA和仑伐替尼联合治疗在克服HCC的LR方面发挥协同作用。
由于EPA是多种醛糖还原酶的已知抑制剂，为了进一步验证靶向AKR1B10在与仑伐替尼协同治疗中的关键作用，研究人员直接采用了CRISPR/Cas9-sgRNA系统的基因敲除方法。Western blot测试证实了AKR1B10 sgRNA在Huh7和Hep3B LR细胞中的出色敲除效率。正如预期的那样，AKR1B10敲除显著增强了仑伐替尼敏感性，表现为LR细胞的IC50 值降低和细胞凋亡增加。与此一致的是，在LR细胞中敲除AKR1B10降低了细胞ATP水平、葡萄糖摄取和细胞外乳酸水平，表明有氧糖酵解受到抑制。Seahorse分析进一步揭示了在LR细胞中敲除AKR1B10后ECAR降低，包括基础糖酵解和糖酵解能力。在使用Huh7 LR细胞的体内小鼠模型中，AKR1B10敲除本身表现出显著的肿瘤抑制作用，并且关键的是，与仑伐替尼协同作用，其程度与EPA联合仑伐替尼相当。敲除AKR1B10和用EPA进行药理学抑制均产生几乎相同的治疗结果——无论是作为单药治疗还是与仑伐替尼联合——这一事实提供了一条有力且趋同的证据链。
打赏
